異源反應(yīng)性NK細(xì)胞受體與宿主MHCⅠ類分子匹配程度對aGVHD的影響研究.pdf

1、骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)是治療血液系統(tǒng)良惡性疾病和某些實(shí)體瘤的有效手段,但移植后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD),尤其是急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD),在很大程度上限制了其在臨床上的廣泛開展。國內(nèi)外學(xué)者都在積極探尋降低aGVHD的方法。有研究發(fā)現(xiàn):在異基因造血干細(xì)胞移植中,供

2、者來源的同種異體反應(yīng)性自然殺傷細(xì)胞(allo-reactive natural killer cells,allo-NK細(xì)胞)可以清除受者體內(nèi)的白血病細(xì)胞,同時(shí)降低aGVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。由于NK細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)依賴于其受體與特異性配體的識(shí)別與匹配程度,因此推測allo-NK細(xì)胞對aGVHD的抑制作用可能與其受體與配體MHCⅠ類分子的匹配程度有關(guān)。本研究初步探討了allo-NK細(xì)胞受體與宿主MHCI類分子的匹配程度對其抑制aGV

3、HD的作用和機(jī)制,為進(jìn)一步開展無關(guān)供者或半相合NK細(xì)胞(如無償獻(xiàn)血者的NK細(xì)胞)治療aGVHD的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　研究中首先觀察了外源性骨髓細(xì)胞在主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)全相合、半相合和全不相合受者小鼠內(nèi)的分布和遷移規(guī)律,基于此,建立了供/受者不同MHC分子相合程度的aGVHD小鼠模型。實(shí)驗(yàn)思路簡述如下:首先,分離螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6J的

4、骨髓細(xì)胞,通過尾靜脈輸注給經(jīng)過γ射線輻照的C57BL/6J(全相合)、CB6F1(半相合)和BALB/c(全不相合)小鼠,在不同時(shí)間點(diǎn),通過活體成像技術(shù)觀察熒光素酶標(biāo)記的骨髓細(xì)胞在受者體內(nèi)的分布規(guī)律。結(jié)果表明:外源性骨髓細(xì)胞在三類受者體內(nèi)的時(shí)空分布規(guī)律均呈下列特點(diǎn):外源性骨髓細(xì)胞首先遷移到肺臟,然后依次向肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)遷移,最終定居于骨髓后重建造血,但在細(xì)胞分布與遷移的數(shù)量和速度上表現(xiàn)出明顯的不同。輸后1h外源性骨髓細(xì)胞主要分

5、布在肺臟,BALB/c小鼠肺臟中的骨髓細(xì)胞多于CB6F1和C57BL/6J小鼠;輸后4h,肝臟和脾臟中開始出現(xiàn)外源性骨髓細(xì)胞并逐漸增多,BALB/c小鼠脾臟中的骨髓細(xì)胞增長最快;輸后24h,外源性骨髓細(xì)胞主要集中在腸系膜,BALB/c小鼠腸系膜中的外源性細(xì)胞數(shù)量要多于CB6F1小鼠,后者又多于C57BL/6J小鼠。以上結(jié)果說明,供者細(xì)胞與受者M(jìn)HC分子不相合程度影響著骨髓細(xì)胞遷移到肺臟、肝臟、脾臟和腸系膜淋巴系統(tǒng)的時(shí)間、速度,并決定著在

6、這些臟器中駐留的數(shù)量和時(shí)程。
　　為了研究allo-NK細(xì)胞與受者M(jìn)HC分子匹配程度對aGVHD的影響,首先要建立合適的不同MHC相合程度的aGVHD動(dòng)物模型。傳統(tǒng)移植理論認(rèn)為預(yù)處理的γ射線強(qiáng)度是影響B(tài)MT后植入和aGVHD的主要因素,本研究中分別設(shè)立8Gy、6Gy和4Gy輻照劑量組,觀察、評價(jià)單純輻照和輻照后骨髓移植小鼠的生存期、造血恢復(fù)情況和嵌合狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中將輻照的CB6F1和BALB/c小鼠作為受者,單純輻照組小鼠只輻照不移

7、植骨髓細(xì)胞,移植組小鼠輻照后輸入C57BL/6J小鼠的骨髓細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn):8Gy單純輻照組和移植組小鼠外周血中白細(xì)胞和血小板在+1d開始顯著下降,+7d時(shí)降低到最低值后緩慢回升,小鼠均在+15~+21d內(nèi)死亡,瀕死時(shí)嵌合率大于90％;6Gy移植組小鼠在+7d時(shí),白細(xì)胞和血小板降低到最低值,隨后逐漸恢復(fù),+2w時(shí)嵌合率為50%~75%,存活期超過3個(gè)月;4Gy單純輻照組和移植組小鼠外周血中白細(xì)胞和血小板下降幅度小于8Gy和6Gy組,在+7

8、d開始逐漸恢復(fù),+2W時(shí)移植組的嵌合率僅21%~41%。綜合分析生存期、造血功能恢復(fù)和嵌合率的結(jié)果,選擇6Gy作為建立aGVHD模型的預(yù)處理劑量,該模型小鼠活動(dòng)度較好,方便留取檢測樣本,同時(shí)又可形成一定程度的嵌合狀態(tài)。
　　為了觀察allo-NK細(xì)胞受體與受者M(jìn)HCⅠ類分子的匹配程度對aGVHD的影響和機(jī)制,我們將經(jīng)6Gy輻照后的CB6F1和BALB/c小鼠作為受者,C57BL/6J小鼠作為供者,輸入骨髓細(xì)胞和脾臟單個(gè)核細(xì)胞的小鼠

9、作為aGVHD組(對照組),輸入骨髓細(xì)胞、脾臟單個(gè)核細(xì)胞和allo-NK細(xì)胞的小鼠作為aGVHD+NK組(治療組),其中CB6F1小鼠的MHCⅠ類分子與輸入的NK細(xì)胞受體為50%錯(cuò)配,BALB/c小鼠與輸入的NK細(xì)胞受體為100%錯(cuò)配。結(jié)果發(fā)現(xiàn)allo-NK細(xì)胞可以促進(jìn)嵌合狀態(tài)的形成和造血功能的恢復(fù),同時(shí)降低aGVHD的發(fā)生率并減輕其嚴(yán)重程度,且該效應(yīng)和供者NK細(xì)胞受體與受者M(jìn)HCI類分子的匹配程度相關(guān)。CB6F1小鼠治療組與對照組相比

10、,輸入allo-NK細(xì)胞雖然可以加快白細(xì)胞的造血重建,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而BALB/c小鼠,輸入allo-NK細(xì)胞后,白細(xì)胞造血重建明顯加快,同時(shí)顯著改善了aGVHD的臨床表現(xiàn)和病理評分,特別是改善了肝臟的病理改變。進(jìn)一步的研究表明:與未輸入NK細(xì)胞相比,輸入allo-NK細(xì)胞的受者外周血中IFN-γ和IL-17A水平下降、IL-10水平升高,脾臟中的Th1/Th2細(xì)胞比值降低、Treg/Th17細(xì)胞比值升高。
　　通過以上研

11、究可以得出以下結(jié)論:
　　(1)外源性骨髓細(xì)胞在不同MHC分子匹配程度受者的肺臟、脾臟和腸道中的分布和遷移規(guī)律不同,這可能與不同MHC分子匹配程度的骨髓移植后aGVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重程度不同有關(guān)。
　　(2)allo-NK細(xì)胞可以促進(jìn)骨髓移植小鼠的造血功能恢復(fù),改善aGVHD的臨床癥狀和病理評分,且該作用與allo-NK細(xì)胞受體與受者的MHCI類分子的匹配程度有關(guān),不匹配程度越高,則該效應(yīng)越強(qiáng)。
　　(3)allo-N