NK細胞調節(jié)移植抗宿主病中同種反應性T細胞應答的作用及機制研究.pdf

1、在本研究中我們首先分析臨床造血干細胞移植后NK細胞及其受體的重建與aGVHD的關系;接著，我們通過動物模型和體外細胞研究探討供者來源的NK細胞負向調節(jié)aGVHD中的同種反應性T細胞應答的作用及相關機制;最后我們探討達沙替尼和AMD3100兩個藥物對NK細胞的體外擴增、移植物動員和生物學功能的調節(jié)作用。我們的研究有助于深入闡明NK細胞調節(jié)aGVHD中T細胞應答的機制，完善aGVHD的發(fā)生機制，建立aGVHD預警的生物學標志;同時對尋找aG

2、VHD有效預防和治療的新策略具有重大的理論和實際意義。
　　具體研究分為3部分:
　　1) Allo-HSCT后NK細胞及其受體的重建與aGVHD的關系;2）NK細胞抑制aGVHD中同種反應性T細胞應答的作用和機制;3）酪氨酸激酶抑制劑和干細胞動員劑對NK細胞的aGVHD調節(jié)作用的影響。
　　第一章 Allo-HSCT后NK細胞及其受體的重建與aGVHD的關系
　　目的:通過檢測移植后Allo-HSCT后早期NK

3、細胞及其受體的動態(tài)重建規(guī)律，分析與aGVHD的關系，為探討NK細胞在Allo-HSCT中對aGVHD的調節(jié)作用提供線索，并為移植后進一步明確患者aGVHD危險分層和早期預警尋找合適的指標。
　　方法:研究對象為2012年4月至2013年12月在浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心接受異基因造血干細胞移植的患者，共63名患者及相應的健康供者進入臨床研究，在造血干細胞移植后3月內每1-2周采血一次，使用流式細胞術檢查移植物和移植后外

4、周血中T和NK細胞的比例、NK細胞亞群分布、NK細胞表面NKG2D/DNAM-1/NKP46/NKG2A等受體表達以及T細胞表面CD25/CD69/MICA/MICB/PVR/Nectin2等表達，并結合臨床GVHD資料進行統(tǒng)計分析。
　　結果:2012年5月-2013年12月，在浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，共有63例患者納入研究，其中ALL27例，AML26例，NHL2例，MDS7例，CML1例。中位年齡30歲(12

5、歲-50歲)，男性34例，女性29例。接受親緣全相合移植22例，無關供者移植14例，半相合移植27例。共36例患者發(fā)生aGVHD(57.14％)，27例無aGVHD發(fā)生(42.86％)，分別納入aGVHD組和無aGVHD組。在發(fā)生aGVHD組的患者，輸注的移植物中NK細胞的百分比為（8.95±6.38）％、NK細胞絕對計數(shù)(19.87±14.72)*106/Kg、NK與T細胞的數(shù)量比值為0.14±0.09。而在未發(fā)生aGVHD組的患者，

6、輸注的移植物中NK細胞的百分比為（10.64±5.73）％、NK細胞絕對計數(shù)(20.66±10.57)*106/Kg、NK與T細胞的數(shù)量比值為0.20±0.11。aGVHD組與無aGVHD組間比較，NK細胞百分比例和絕對計數(shù)差別無統(tǒng)計意義，而NK∶T比值在無aGVHD組高于aGVHD組，P＜0.05。在移植后較長一段時間內，重建的NK細胞亞群分布與健康供者存在差異，在重建早期，CD56bright、NKG2A+和CD11b+CD27+這

7、些相對不成熟的亞群的比例顯著高于健康對照，隨著時間推移，逐步發(fā)育成熟。移植后最早重建的NK細胞的NKG2A陽性率在aGVHD組為76.00±9.20％，高于無aGVHD組（59.59±6.10％）。移植后早期重建的NK細胞表達活化型受體NKP46與健康供者無顯著差異，而NKG2D和CD226的水平較健康供者降低，其中NKG2D及CD226的水平在aGVHD組低于無aGVHD組。CD226的配體PVR在aGVHD組T細胞表面的表達水平為2

8、470.39±1461.73，高于無aGVHD組（1440.81±648.44，P＜0.05）和健康供者（1148.91±281.64，P＜0.05）。T細胞表面表達Nectin2的水平在移植后aGVHD組與無aGVHD組無顯著差異。NKG2D的配體MICA/B在移植后aGVHD組T細胞表面表達水平為3827.00±1849.34，高于無aGVHD組（1760.18±1010.87，P＜0.05）和健康供者（1570.82±1235.1

9、5，P＜0.05）。在aGVHD患者，NK細胞對活化T細胞的脫顆粒和細胞毒作用顯著低于健康供者，采用IL-15激活能夠部分逆轉aGVHD患者NK細胞的表型和功能缺陷。
　　結論:NK細胞是造血干細胞移植后最早重建的淋巴細胞亞群，其數(shù)量和功能的重建影響aGVHD的進程。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，移植物中NK∶T細胞的比例與aGVHD的發(fā)生率相關。移植后重建的NK細胞表面DNAM-1/NKG2D活化型受體表達水平下降，而NKG2A水平增高，

10、導致其殺傷活化T細胞和負向調節(jié)aGVHD的功能受損。NK細胞重建早期的DNAM-1/NKG2D表達水平與aGVHD的發(fā)生有關。Allo-HSCT后供者NK細胞亞群和受體的早期重建可能參與aGVHD的調節(jié)過程。
　　第二章 NK細胞抑制aGVHD中同種反應性T細胞應答的作用和機制
　　目的:本部分的目的是探討供者來源的NK細胞在動物模型中對aGVHD中的同種反應性T細胞應答的調節(jié)作用，并通過體外實驗進一步闡明相應的分子機制。<

11、br>　　方法:建立小鼠MHC單倍體相合的aGVHD模型，在該模型基礎上比較不同NK∶T細胞輸注比例對小鼠aGVHD的調控作用，對供者T細胞增殖、凋亡以及T細胞亞群的影響;采用流式細胞儀分選供者PBMCs中的CD3+T細胞和CD56+NK細胞，采用PHA、Allo-DC、anti-CD3/CD28單抗刺激CFSE標記的供者T淋巴細胞增殖，比較加入不同比例的供者NK細胞抑制各種刺激引起的T淋巴細胞增殖的能力，采用CFSE-7AAD雙標殺傷

12、實驗和基于CD107a釋放的脫顆粒實驗檢測供者NK細胞對活化的供者T細胞的細胞毒功能，采用抗體阻斷試驗檢測NK細胞殺傷活化T細胞過程中NKG2D、LFA-1、DNAM-1、FAS、NKG2A、TIM-3等受體的功能，采用Western blot檢測與活化的T細胞相互作用后NK細胞內部ERK信號的磷酸化水平。
　　結果:1）在MHC單倍體相合的小鼠GVHD模型中，NK細胞能夠抑制T細胞增殖、促進活化T細胞凋亡，具有GVHD保護作用;

13、2）在淋巴細胞增殖實驗中發(fā)現(xiàn)供者NK細胞能夠抑制PHA、anti-CD3/CD28單抗以及異基因DC刺激引起的供者T細胞增殖，并且隨著NK∶T細胞比例的增加，抑制作用也增強;3）在細胞毒實驗中供者NK細胞能夠選擇性殺傷激活的供者T細胞，而對靜息狀態(tài)下的T細胞沒有殺傷作用，脫顆粒實驗也進一步證實NK細胞僅與激活T細胞共孵育才具有脫顆粒反應，不同亞群的NK細胞對活化T細胞的脫顆粒反應也不同，其中NKG2A+＞ NKG2A-，CD56dim＞

14、 CD56bright;4）與靜息狀態(tài)相比，激活的T細胞表達更高水平的MICA/B、ULBP-1/4、PVR、ICAM-1等激活型NK受體的配體;5)抗體阻斷實驗結果提示NKG2D、DNAM-1、LFA-1促進NK細胞對活化T細胞的細胞毒作用，NKG2A、TIM-3抑制NK細胞對活化T細胞的細胞毒作用，F(xiàn)AS/FASL通路不參與這一過程;6)NK細胞與活化的自身T細胞接觸后10-30min，ERK蛋白即出現(xiàn)快速的磷酸化。
　　結論

15、:我們首先通過小鼠模型證實供者NK細胞能夠抑制T細胞增殖、促進活化T細胞凋亡，具有GVHD保護作用。接著，我們首次在人體體外試驗中證實同種抗原活化的供者T細胞通過上調NK細胞活化型受體的配體，激發(fā)供者NK細胞對自身活化T細胞的細胞毒作用，ERK信號參與NK細胞對活化T細胞的細胞毒作用。NK細胞通過LFA-1/NKG2D/CD226激活受體信號觸發(fā)的細胞毒作用來負向調節(jié)同種抗原刺激的T細胞增殖的能力。
　　第三章干細胞動員劑和酪氨酸

16、激酶抑制劑對NK細胞的aGVHD調節(jié)作用的影響
　　目的:最近研究表明某些移植合并用藥可能會發(fā)揮免疫調節(jié)功能，本部分的目的是探討移植中應用的干細胞動員劑AMD3100和靶向藥物TKIs對NK細胞的移植物動員效應、生物學功能以及體外擴增的調節(jié)作用，旨在探尋能夠充分激發(fā)Allo-HSCT中NK的GVL效應并增強NK細胞的GVHD調節(jié)功能的最佳方案。
　　方法:采用CB6F1小鼠作為受試對象，按干細胞動員方案分4組:(1)PBS對

17、照組;(2)AMD3100組:5mg/Kg，單劑量腹腔注射;(3)G-CSF組:250mg/kg/d*5d，腹腔注射;(4)G-CSF+AMD3100組:劑量同上。給藥后0h、1h、2h、4h尾靜脈采血，通過細胞計數(shù)結合流式細胞儀檢測NK細胞的動員效率;在給藥后立即通過尾靜脈按細胞數(shù)1∶1輸注0.5uM和10uMCFSE標記的親代小鼠C57BL/6(CFSElow)和CB6F1（CFSEhigh）的脾細胞，第4天應用FCM檢測CFSEl

18、ow和CFSEhigh細胞比例并計算NK細胞的體內殺傷率;在給藥后4h獲取小鼠的脾細胞，通過流式分選NK1.1+NK細胞，體外檢測NK細胞對YAC-1細胞株的脫顆粒作用以及殺傷活性。
　　從健康成年人外周血中分離單個核細胞(PBMCs)，采用添加IL-2、IL-15的10％人AB血清的SCGM培養(yǎng)液進行NK細胞的擴增培養(yǎng)，在此培養(yǎng)體系中添加不同濃度的伊馬替尼、尼洛替尼或者達沙替尼，采用細胞計數(shù)和FCM檢測細胞表型比較三種TKIs對

19、NK細胞體外擴增效率的影響;采用CFSE標記增殖試驗檢測達沙替尼對NK細胞抑制同種抗原刺激的T細胞增殖的影響;接著采用脫顆粒試驗結合CFSE/7AAD細胞毒實驗比較三種TKIs對NK細胞殺傷白血病細胞和激活T細胞功能的影響。
　　結果:5mg/kg的AMD3100單次注射能夠有效的動員NK細胞，0h、1h、2h、4h外周血NK細胞絕對數(shù)分別是(4.89±0.83)*105/ml，(22.85±3.91)*105/ml，(34.77

20、±2.82)*105/ml，(23.19±1.82)*105/ml;2h的NK數(shù)達到峰值，4h之后回落。單獨采用G-CSF注射組則無NK細胞動員作用，AMD3100+G-CSF組與AMD3100組具有類似的NK細胞動員規(guī)律，在各時間點兩組間的NK細胞絕對數(shù)無顯著差異。在NK細胞體內殺傷實驗中，G-CSF組對親代細胞的排斥率為62.14±2.34％，低于PBS對照組69.09±2.64％; AMD3100組對親代細胞的排斥率為80.67±

21、4.87％，高于PBS對照組(P＜0.05)，AMD3100+G-CSF組與AMD3100組間無顯著差異(P＞0.05)。在體外研究中，AMD3100組NK細胞的脫顆粒反應以及殺傷效率與PBS對照組間無顯著差異，而G-CSF組以及G-CSF+AMD3100組NK細胞的體外細胞毒功能低于對照組。
　　三種TKIs中，只有達沙替尼能夠在體外增加NK細胞的體外擴增效率，而伊馬替尼和尼洛替尼不能促進NK細胞的擴增。隨著培養(yǎng)體系中達沙替尼濃

22、度的增加，NK細胞的純度逐步升高，但是高濃度的達沙替尼還會引起NK細胞的凋亡，NK細胞的絕對數(shù)在20nM達到峰值。采用20nM的達沙替尼作用后的NK細胞能夠更加有效地抑制同種抗原刺激后的自體T細胞增殖，并且達沙替尼能夠增加NK細胞對活化T細胞以及白血病細胞的細胞毒作用。達沙替尼體外擴增的NK細胞中細胞毒功能較弱的NKG2A+CD57-亞群比例下降，而細胞毒功能較強的NKG2A-CD57+亞群比例增高。達沙替尼能夠促進NK細胞表面的CD2

23、26、NKP46及NKG2D等活化型受體表達的上調。
　　結論:AMD3100用于造血干細胞移植的動員可以提高移植物中NK細胞的數(shù)量，增加移植物中NK∶T比例，并且不影響NK細胞的細胞毒功能。適當濃度的達沙替尼可以增強NK細胞體外擴增的效率，并能夠上調擴增的NK細胞表面活化型受體的表達和優(yōu)先擴增胞毒功能較強的NKG2ACD57+亞群，從而增強NK細胞對活化T細胞和AML細胞的細胞毒作用。我們的研究為目前Allo-HSCT中通過聯(lián)合