巴戟天正丁醇提取物對缺氧復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、凋亡是急性心肌缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞的死亡形式之一。細(xì)胞凋亡是一種能動性的生理性細(xì)胞死亡過程，為一系列基因活動引起的級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，具有特征性的形態(tài)和生化改變。因此，深入研究急性心肌缺血再灌注過程中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及有效的干預(yù)措施，對心肌缺血再灌注損傷(IschemicReperfusionInjuryIRI)的防治具有重要意義。 中藥巴戟天(RadixMorindaeofficinalis，RMO)是茜草科巴戟屬植物巴戟天(M

2、orindaeofficinalisHow,MOH)的干燥根，具有補(bǔ)腎陽、壯筋骨、祛風(fēng)濕等功效。以往的研究證實巴戟天對冠狀動脈結(jié)扎法和體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，但巴戟天能否抑制缺血再灌注過程中的心肌細(xì)胞凋亡，目前尚未見報道。本課題采用離體純化培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞建立缺氧復(fù)氧(Anoxia-reoxygenation,A/R)模型，模擬在體的心肌缺血再灌注，觀察在該模型上心肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象及巴戟天正丁醇提取物(n-

3、butanolextrateofRadixMorindaeofficinalis，BEM)對缺氧復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。以丹參注射液(SalviaMilitorrhizoinjection,SMII)為陽性對照。 方法；實驗采用新生1-3d的Wistar大鼠的乳鼠，雌雄不拘，在無菌條件下開胸取出心臟，PBS緩沖液洗滌，剪碎心肌，用0.125％胰蛋白酶分次消化成單細(xì)胞懸液，離心收集沉淀，用含15％胎牛血清培養(yǎng)

4、液懸浮分散細(xì)胞，差速貼壁法純化后制成濃度為5×105·ml-1的細(xì)胞懸液，接種到25ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，實驗采用培養(yǎng)4天后的原代心肌細(xì)胞。用缺氧溶液置換正常培養(yǎng)液密閉培養(yǎng)30min造成缺氧，用復(fù)氧溶液置換缺氧溶液培養(yǎng)120min后造成再復(fù)氧損傷。實驗隨機(jī)分為六組：①正常細(xì)胞培養(yǎng)組(Control)，②缺氧復(fù)氧(A/R)模型組，③A/R+BEM小劑量(0.03g·L-1)組，④A/R+BEM中劑量(0.10g·L-1)組，⑤A/R+BEM大

5、劑量(0.30g·L-1)組，⑥A/R+SMII大劑量(0.96g·L-1)分別從形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方面觀察BEM對缺氧復(fù)氧模型中乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果；1心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)3天后，倒置顯微鏡下可見心肌細(xì)胞貼壁，成簇生長，整個胞體折光性強(qiáng)，有立體感，伸出偽足，并連接成片，且搏動規(guī)則，頻率約80-100次/min。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多樣化，如圓形、梭形及不規(guī)則三角形。缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞偽足縮短或消

6、失，折光性下降，搏動減弱或消失。BEM各給藥組心肌細(xì)胞形態(tài)較A/R組得到了不同程度的改善，BEM(0.30g·L-1)組和SMII組心肌細(xì)胞形態(tài)接近正常。 2心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察心肌細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示，正常細(xì)胞培養(yǎng)組細(xì)胞核膜表面光滑，核中染色質(zhì)疏松，密度均一，超微結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞器多。缺氧復(fù)氧模型組可見胞體變小，核膜皺縮，染色質(zhì)凝集，有不均勻邊集現(xiàn)象，部分染色質(zhì)在完整的核膜下集聚呈典型半月體樣改變，核深染，固縮，線粒體有空

7、泡變性。BEM各給藥組隨著劑量的增加多數(shù)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較A/R組得到不同程度的改善，少數(shù)有染色質(zhì)輕度邊集，核深染等形態(tài)學(xué)變化，BEM(0.30g·L-1)組和SMII組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近正常。 3DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測心肌細(xì)胞DNA梯狀條帶正常心肌細(xì)胞培養(yǎng)組DNA電泳呈一條整齊的條帶，為正?；蚪MDNA帶形，緊靠加樣孔。缺氧復(fù)氧模型組DNA電泳條帶呈凋亡特有的云梯狀圖譜。BEM各給藥組隨劑量的增加，電泳中DNA的梯狀條帶逐漸減弱。

8、BEM(0.30g·L-1)組與SMII組接近正常基因組DNA帶形。 4TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)正常心肌細(xì)胞培養(yǎng)組偶見TUNEL染色陽性細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞胞核呈綠色。缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞有較多的陽性標(biāo)記，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色顆粒，染色質(zhì)邊集，可見半月體改變。BEM各給藥組隨劑量的增加陽性細(xì)胞核減少，其凋亡指數(shù)(13.00±1.16、9.50±1.35、5.10±0.88)與缺氧復(fù)氧模型組(15.90±1.45)相比差異有高度顯著性(

9、P＜0.01)，BEM(0.30g·L-1)組多數(shù)細(xì)胞核呈正常反應(yīng)，與SMII組(4.30±0.95)無明顯差異(P＞0.05)。 5免疫組化法檢測心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)用陽性細(xì)胞的平均灰度值表示Bcl-2、Bax表達(dá)的量，各組心肌細(xì)胞胞漿中均有Bcl-2、Bax表達(dá)，免疫組化染色可見胞漿中有棕黃色顆粒。與正常細(xì)胞培養(yǎng)組相比，缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下降(P＜0.01)，Bax的表達(dá)上升(P＜0.01)，

10、缺氧復(fù)氧+BEM(0.03g·L-1、0.10g·L-1、0.30g·L-1)各劑量組可分別使心肌細(xì)胞Bcl-2陽性表達(dá)平均灰度值從缺氧復(fù)氧組(94.13±1.50)上升至(107.77±1.88,123.87±3.32、129.20±2.31)(P＜0.01)，細(xì)胞Bax陽性表達(dá)平均灰度值從缺氧復(fù)氧組(152.58±1.42)下降至(146.92±3.56、132.43±1.06、120.51±1.06)(P＜0.01)，BEM(0.

11、30g·L-1)組與SMII組(121.50±1.64)Bcl-2、Bax表達(dá)的量無明顯差異(P＞0.05)。Bcl-2與Bax的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.983)(P＜0.01)。 結(jié)論；1.缺氧復(fù)氧模型中進(jìn)一步觀察到心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報道一致。 2.本實驗從心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、DNA電泳梯狀圖譜變化及對心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測結(jié)果證明巴戟天正丁醇提取物可抑制缺氧復(fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其作用隨劑量的增加而加強(qiáng)。