中藥雷公藤內(nèi)酯醇、尿多酸肽對(duì)地塞米松耐藥及敏感的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株的作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分雷公藤內(nèi)酯醇通過影響細(xì)胞生存信號(hào)通路及激素受體表達(dá)誘導(dǎo)對(duì)地塞米松耐藥及敏感的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡 目的： 探討雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)地塞米松耐藥及敏感的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株MM．1R、MM．1S細(xì)胞的作用機(jī)制并探討其作用機(jī)制。 方法： 采用MTT比色法研究雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)對(duì)MM．1R、MM．1S細(xì)胞株以及對(duì)常規(guī)化療方案VAD方案治療無效的MM患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體

2、外生長(zhǎng)抑制作用；采用Wright—Giemsa染色、DNA凝膠電泳檢測(cè)DNALadder的條帶、流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)亞G1峰和AnnexinV/PI雙染色等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；采用流式細(xì)胞儀JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的改變；Western—blot檢測(cè)TPL作用后MM．1R、MM．1S細(xì)胞Caspase家族蛋白，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族，凋亡抑制蛋白IAPs家族蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步加用Caspase-3抑制劑Z—DEVD—FMK

3、來觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；提取核漿蛋白以觀察TPL作用對(duì)NF—κB信號(hào)通路的影響，并應(yīng)用免疫熒光方法來檢測(cè)TPL對(duì)NF—κB核轉(zhuǎn)位過程的影響；Western—blot檢測(cè)TPL對(duì)MM．1R、MM．1S細(xì)胞：PI3K/Akt和NF—κB信號(hào)通路相關(guān)生存蛋白的影響，并進(jìn)一步加用PI3K抑制劑LY294002和NF—κB抑制劑PDTC來明確兩條信號(hào)通路的相關(guān)性及機(jī)制；用RT—PCR方法檢TPL對(duì)編碼PI3Kp110α、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(Insu

4、lin—likegrowthfactor-1receptor，IGF-1R)蛋白的PIK3CA、IGF1R基因的影響，以明確TPL治療的上游靶點(diǎn)。加用白介素-6(Interleukin-6，IL-6)來明確TPL抑制MM．1細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)是否能被減弱，并探討TPL增加MM．1R、MM．1S細(xì)胞株對(duì)Dex的敏感性與激素受體(GlucocorticoidReceptor．GR)之間的關(guān)系。從microRNA水平、mRNA、蛋白水平檢測(cè)MM．

5、1R、MM．1S細(xì)胞株的GR在TPL作用前后的改變。 結(jié)果： ①TPL可以抑制人MM細(xì)胞株MM．1S和對(duì)Dex耐藥的MM．1R細(xì)胞株的生長(zhǎng)；TPL還可抑制難治的MM患者原代細(xì)胞的生長(zhǎng)，均呈濃度和時(shí)間依賴性。②TPL可以誘導(dǎo)MM．1R、MM．1S細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴性；TPL作用后可產(chǎn)生典型的DNALadder條帶。③不同濃度TPL作用可以激活Caspase-9，-3，呈濃度依賴性，并伴有明顯的線粒體膜電位下降；當(dāng)TPL

6、濃度為10ng/mL時(shí)激活Caspase-8，亦呈濃度依賴性；Caspase-3抑制劑可以抑制TPL誘導(dǎo)的MM．1R、MM．1S細(xì)胞凋亡．④不同濃度TPL作用可以下調(diào)Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl—xl、Mcl-1、p—Bad和上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，呈濃度依賴性；還可上調(diào)Smac的表達(dá)，呈濃度依賴性。⑤TPL可以抑制MM．1R、MM．1S細(xì)胞株IAPs家族中的cIAP1，xIAP和Survivin的表達(dá)，呈濃度依賴性。⑥TPL抑制

7、MM．1R、MM．1S細(xì)胞株的IKBα磷酸化和NF—κB核轉(zhuǎn)位過程。⑦TPL可降低IGF-1R基因及蛋白水平的表達(dá)，下調(diào)PIK3CAmRNA表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)途徑；PI3K抑制劑LY294002與TPL聯(lián)用可以明顯抑制p—Akt表達(dá)，并進(jìn)一步影響其下游的信號(hào)途徑，包括NF—κB信號(hào)通路的蛋白而誘導(dǎo)MM．1R、MM．1S細(xì)胞凋亡。⑧TPL抑制MM．1R、MM．1S細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)不受IL-6的影響，還可以增加MM．1R、MM．1

8、S細(xì)胞對(duì)地塞米松及蛋白酶體抑制劑PS341的敏感性。⑨不同濃度TPL處理后可降低GR相關(guān)NmicroRNAN表達(dá)，增加MM．1R、MM．1S細(xì)胞株的GR基因、p—GR(磷酸化GR)蛋白及GR直接靶基因：激素誘導(dǎo)鋅指蛋白(glucocorticoid—inducedleucinezipper—GILZ)的表達(dá)。 小結(jié)： ①TPL可以抑制MM．1S和對(duì)Dex耐藥的MM．1R細(xì)胞株及MM原代細(xì)胞生長(zhǎng)，呈時(shí)間和劑量依賴性，并且該

9、抑制作用不能被IL-6減弱。②TPL通過啟動(dòng)內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細(xì)胞凋亡，并以內(nèi)源性(線粒體)途徑為主，伴有明顯的線粒體膜電位下降。③TPL通過下調(diào)Bcl-2家族蛋白Bcl—xl、Mcl-1、p—Bad，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)以及抑制IAPs家族cIAP1、xIAP和Survivin的表達(dá)導(dǎo)致線粒體損傷和Caspase-9，-3激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。④TPL通過抑制IκBα磷酸化，從而抑制NF—κB核轉(zhuǎn)位；

10、TPL對(duì)MM．1R、MM．1S細(xì)胞株NF—κB信號(hào)通路的影響主要通過對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。⑤TPL降低IGF-1R基因及蛋白水平的表達(dá)；減少PIK3CA基因的表達(dá)而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，并進(jìn)一步通過影響其下游的信號(hào)途徑，如NF—κB信號(hào)通路等而誘導(dǎo)MM．1R、MM．1S細(xì)胞凋亡。⑥TPL下調(diào)MM．1R、MM．1S細(xì)胞內(nèi)GR相關(guān)的成熟體microRNA(miR-181a、miR-142-5p)的表達(dá)，增加p—GR

11、及GILZ的表達(dá)，并且該效應(yīng)不能被IL-6拮抗，從而增加MM．1R、MM．1S細(xì)胞對(duì)Dex的敏感性。TPL還可增加MM．1R、MM．1S細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑PS341的敏感性。 第二部分尿多酸肽(CDAⅡ)抗多發(fā)性骨髓瘤作用初步機(jī)制研究 目的： 探討CDA—Ⅱ?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤的作用及機(jī)理，為CDA—Ⅱ應(yīng)用于MM治療提供理論依據(jù)。 方法： 采用MTT比色法研究CDA—Ⅱ?qū)PMI8226、U266、M

12、M．1R、MM．1S細(xì)胞株以及對(duì)MM患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用；采用Wright—Giemsa染色、DNA凝膠電泳檢測(cè)DNALadder條帶、流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的改變；用Western—blot方法檢測(cè)CDA—Ⅱ作用后RPMI8226、U266、MM．1R、MM．1S細(xì)胞Caspase家族蛋白，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族，凋亡抑制蛋白IAPs家族蛋白的表達(dá)，并

13、進(jìn)一步加用Caspase-3抑制劑Z—DEVD—FMK來觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果；應(yīng)用免疫熒光方法來檢測(cè)CDA—Ⅱ?qū)F—κB核轉(zhuǎn)位過程的影響。 結(jié)果： ①CDA—Ⅱ可以明顯抑制RPMI8226、U266、MM．1R、MM．1S細(xì)胞株生長(zhǎng)，呈時(shí)間和劑量依賴性，而且對(duì)于患者原代細(xì)胞也具有抑制生長(zhǎng)的作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性，但不影響正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)正常骨髓幾乎無抑制作用。②CDA—Ⅱ可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞

14、凋亡，可產(chǎn)生典型的DNALadder條帶。③CDA—Ⅱ通過啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細(xì)胞凋亡，并伴有明顯的線粒體膜電位下降。④CDA—Ⅱ通過下調(diào)Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)以及抑制IAPs家族中xIAP和Survivin的表達(dá)導(dǎo)致線粒體損傷和Caspase-9，-3激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。⑤CDA—Ⅱ可以抑制NF—κB的核轉(zhuǎn)位過程，從而使得MM細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。 小結(jié)：

15、 ①CDA—Ⅱ可以明顯抑制MM細(xì)胞株及患者原代細(xì)胞生長(zhǎng)，呈時(shí)間和劑量依賴性。②CDA—Ⅱ可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡。③CDA—Ⅱ引起明顯的線粒體膜電位下降，啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細(xì)胞凋亡。④CDA—Ⅱ可下調(diào)Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)以及抑制IAPs家族中xIAP和Survivin的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。⑤CDA—Ⅱ可以抑制NF—κB的核轉(zhuǎn)位而抑制MM細(xì)胞生長(zhǎng)。 結(jié)論：

16、 TPL能抑制對(duì)Dex耐藥及敏感的MM細(xì)胞生長(zhǎng)，并且該抑制生長(zhǎng)的作用不能被IL-6拮抗。其機(jī)理主要為抑制PI3K/Akt/NF—κB生存信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；下調(diào)GR相關(guān)microRNA表達(dá)水平，增加GR基因及其p—GR蛋白表達(dá)，增加GILZ的表達(dá)，從而增加MM．1R、MM．1S細(xì)胞對(duì)Dex的敏感性。 CDA—Ⅱ可以通過抑制NF—κB的核轉(zhuǎn)位過程，誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細(xì)胞凋亡，為CDA—Ⅱ用于臨床治療MM提供實(shí)驗(yàn)和