全新抗菌肽基因的功能及相關研究.pdf

1、根據本實驗室首先克隆的mL52基因序列設計引物，以人胎肝cDNA文庫為模板，通過PCR擴增獲得了人類同源新基因，因其富含甘氨酸而命名為一hGlyrichin。在生物信息學分析提示其為抗菌肽和初步證實該基因具有抗菌作用的基礎上，為了尋找該蛋白序列的核心功能區(qū)段，進一步借助生物信息學分析結果，分段合成了系列肽段并對這些肽段的抗菌活性進行了測試，結果證實，從第42到60位氨基酸的19個氨基酸(pCM-19)為該蛋白的核心功能區(qū)。為此，對pCM

2、-19的抗菌活性、抗菌作用機理及抗菌肽的普遍副作用進行了系統(tǒng)研究。實驗結果證實，pCM-19不僅具有抗實驗室工程菌的活性，而且具有抗鼠疫桿菌、傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌和腦膜炎球菌的作用。更可喜的是該肽段具有抗攜帶氨芐青霉素抗性基因的實驗室工程菌和抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的活性，提示pCM．19具有廣譜抗菌作用并為該抗菌肽的應用提供了有價值的實驗數(shù)據。pCM-19抗菌活性的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，該肽段經100~C加熱30rain和60min及反

3、復凍融3次，其抗菌活性完全不受影響；溶液狀態(tài)在4~C放置80天，抗菌活性仍可保留98％以上；經胰蛋白酶處理60min后，抗菌活性保留30％。這些實驗結果表明，pCM一19具有良好的穩(wěn)定性，也為其發(fā)展成藥提供了重要實驗數(shù)據。 為了研究該肽段的抗菌作用機理，采用流式熒光激活細胞分析(FACScan)和掃描電子顯微鏡分析了pCM-19對靶細菌膜完整性的影響。兩種方法所得結果一致提示，pCM-19可能作用于細菌的細胞壁和／或細胞膜，通過

4、破壞膜的完整性并進而導致靶細菌胞質內容物外泄而發(fā)揮殺菌作用。這與目前已知陽離子抗菌肽的主要作用機制類似。 抗菌肽的溶血作用是抗菌肽常見的副作用，也是某些抗菌肽發(fā)展成藥的主要障礙。為此，本文對pCM-19的溶血作用進行了體內、外測試，結果證實，pCM．19在體外無溶解人紅細胞的作用，在體內無溶解鼠紅細胞的作用。 上述研究表明：pCM一19有確定的廣譜抗菌作用；理化性質穩(wěn)定；抗菌作用主要通過破壞靶細菌細胞膜的完整性實現(xiàn)；體內