LiCl和Aβ-,25-35-在大鼠神經(jīng)干細胞分化過程中對Tau蛋白磷酸化的影響.pdf

1、研究背景 神經(jīng)干細胞是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)的、具有自我更新和多分化潛能的干細胞。其主要功能是作為一種后備儲備，參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復或細胞正常的死亡更新。近年來研究發(fā)現(xiàn)成年哺乳動物和靈長類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在干細胞。神經(jīng)干細胞可以誘導分化成神經(jīng)元或膠質細胞。 Tau蛋白是一種重要的微管相關蛋白，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中。正常的Tau蛋白可以促進微管的組裝，維持微管的穩(wěn)定，連接其他細胞骨架蛋白等。在一些中樞系統(tǒng)疾病

2、中Tau蛋白被異常修飾，如過度磷酸化。這種被異常修飾的Tau蛋白喪失了Tau蛋白的生理功能，結果使微管解聚，細胞骨架遭到破壞，正常軸突轉運系統(tǒng)受損，突觸丟失及退行性變。體內研究表面，移植的神經(jīng)干細胞表現(xiàn)出增殖、遷移并能夠形成特定神經(jīng)細胞類型，但在一些中樞系統(tǒng)疾病，神經(jīng)元持續(xù)性喪失時，這種補充“救活”機制卻沒有發(fā)生，這可能和某些內外因素阻礙了這種神經(jīng)干細胞的正常分化，抑制了其形成有相應功能的神經(jīng)元有關。因此，研究神經(jīng)干細胞分化過程中，Ta

3、u蛋白的磷酸化和影響Tau蛋白磷酸化的機制也就成為關鍵問題之一。因此本實驗選取Tau蛋白有一定代表性的兩個磷酸化位點Tau[pS396]、Tau[pS262]和磷酸化調節(jié)激酶GSK-3β，通過免疫細胞化學和免疫蛋白印跡的方法，在神經(jīng)干細胞分化7天時檢測這兩個位點的磷酸化情況，并用Aβ<,25>-<,35>和LiCl進行干預，研究神經(jīng)干細胞分化過程中，Tau蛋白的磷酸化狀態(tài)和LiCl和Aβ<,25>-<,35>對Tau蛋白磷酸化的影響，并

4、探討Tau蛋白磷酸化的機制。 實驗方法 無菌條件下從新生大鼠海馬齒狀回分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，用D/F培養(yǎng)液(含20ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、2﹪B27)在37℃，5﹪CO<,2>的條件下培養(yǎng)。神經(jīng)干細胞培養(yǎng)到第3代時，撤除bFGF和EGF，加入10﹪的胎牛血清使其分化。第三代神經(jīng)干細胞分化7天后分為三組：正常組；LiCl預處理組；AB組。觀測細胞生長狀態(tài)，收集細胞采用免疫細胞化學染色和Western-b

5、lot的方法檢測Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTry<'279,216>]在三組細胞中的表達情況。實驗結果均采用SPSS10.0軟件包分析。免疫細胞化學結果采用卡方檢驗，Western-blot結果采用單因素方差分析。 實驗結果 1.培養(yǎng)36小時后對每組細胞進行形態(tài)上的觀察，liCl預處理組和Aβ組的活細胞計數(shù)少于正常組，其中Aβ組減少明顯。在一些視野中可見正常組的貼壁細胞要多于其它兩組，

6、在一些視野中可見正常組貼壁細胞的突起的數(shù)量和長度要高于其它兩組。在Aβ組和LiCl預處理組中，貼壁細胞的折光性也有所下降。 2.正常組神經(jīng)干細胞分化過程中Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTyr<'279,216>]有表達，主要表現(xiàn)為細胞胞漿和軸突染色呈陽性結果。 3.免疫細胞化學染色和Western-blot結果都顯示，Aβ組和正常組細胞內Tau蛋白在Ser396位點，Ser262位點的磷酸化

7、水平要高LiCl預處理組(P<0.01)。Aβ組和正常組細胞內GSK-3β[pTyr<'279,216>]的表達要強于LiCl預處理組(P<0.01)。 實驗結論 1.神經(jīng)干細胞分化過程中Tau蛋白具有一定程度的磷酸化水平。 2.氯化鋰(1ithium Chloride，LiCl)可以抑制GSK-3β的活性，降低Tau蛋白磷酸化水平，而Aβ<,25-35>可通過上調活化型GSK-3β的表達來提高經(jīng)過LiCl預處理