LiCl和Aβ-,25-35-在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)Tau蛋白磷酸化的影響.pdf

1、研究背景 神經(jīng)干細(xì)胞是指分布于神經(jīng)系統(tǒng)的、具有自我更新和多分化潛能的干細(xì)胞。其主要功能是作為一種后備儲(chǔ)備，參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)或細(xì)胞正常的死亡更新。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)成年哺乳動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。 Tau蛋白是一種重要的微管相關(guān)蛋白，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中。正常的Tau蛋白可以促進(jìn)微管的組裝，維持微管的穩(wěn)定，連接其他細(xì)胞骨架蛋白等。在一些中樞系統(tǒng)疾病

2、中Tau蛋白被異常修飾，如過(guò)度磷酸化。這種被異常修飾的Tau蛋白喪失了Tau蛋白的生理功能，結(jié)果使微管解聚，細(xì)胞骨架遭到破壞，正常軸突轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受損，突觸丟失及退行性變。體內(nèi)研究表面，移植的神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)出增殖、遷移并能夠形成特定神經(jīng)細(xì)胞類型，但在一些中樞系統(tǒng)疾病，神經(jīng)元持續(xù)性喪失時(shí)，這種補(bǔ)充“救活”機(jī)制卻沒(méi)有發(fā)生，這可能和某些內(nèi)外因素阻礙了這種神經(jīng)干細(xì)胞的正常分化，抑制了其形成有相應(yīng)功能的神經(jīng)元有關(guān)。因此，研究神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中，Ta

3、u蛋白的磷酸化和影響Tau蛋白磷酸化的機(jī)制也就成為關(guān)鍵問(wèn)題之一。因此本實(shí)驗(yàn)選取Tau蛋白有一定代表性的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)Tau[pS396]、Tau[pS262]和磷酸化調(diào)節(jié)激酶GSK-3β，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫蛋白印跡的方法，在神經(jīng)干細(xì)胞分化7天時(shí)檢測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化情況，并用Aβ<,25>-<,35>和LiCl進(jìn)行干預(yù)，研究神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中，Tau蛋白的磷酸化狀態(tài)和LiCl和Aβ<,25>-<,35>對(duì)Tau蛋白磷酸化的影響，并

4、探討Tau蛋白磷酸化的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法 無(wú)菌條件下從新生大鼠海馬齒狀回分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，用D/F培養(yǎng)液(含20ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、2﹪B27)在37℃，5﹪CO<,2>的條件下培養(yǎng)。神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)到第3代時(shí)，撤除bFGF和EGF，加入10﹪的胎牛血清使其分化。第三代神經(jīng)干細(xì)胞分化7天后分為三組：正常組；LiCl預(yù)處理組；AB組。觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，收集細(xì)胞采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western-b

5、lot的方法檢測(cè)Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTry<'279,216>]在三組細(xì)胞中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS10.0軟件包分析。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)，Western-blot結(jié)果采用單因素方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.培養(yǎng)36小時(shí)后對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)上的觀察，liCl預(yù)處理組和Aβ組的活細(xì)胞計(jì)數(shù)少于正常組，其中Aβ組減少明顯。在一些視野中可見(jiàn)正常組的貼壁細(xì)胞要多于其它兩組，

6、在一些視野中可見(jiàn)正常組貼壁細(xì)胞的突起的數(shù)量和長(zhǎng)度要高于其它兩組。在Aβ組和LiCl預(yù)處理組中，貼壁細(xì)胞的折光性也有所下降。 2.正常組神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTyr<'279,216>]有表達(dá)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿和軸突染色呈陽(yáng)性結(jié)果。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western-blot結(jié)果都顯示，Aβ組和正常組細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白在Ser396位點(diǎn)，Ser262位點(diǎn)的磷酸化

7、水平要高LiCl預(yù)處理組(P<0.01)。Aβ組和正常組細(xì)胞內(nèi)GSK-3β[pTyr<'279,216>]的表達(dá)要強(qiáng)于LiCl預(yù)處理組(P<0.01)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1.神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中Tau蛋白具有一定程度的磷酸化水平。 2.氯化鋰(1ithium Chloride，LiCl)可以抑制GSK-3β的活性，降低Tau蛋白磷酸化水平，而Aβ<,25-35>可通過(guò)上調(diào)活化型GSK-3β的表達(dá)來(lái)提高經(jīng)過(guò)LiCl預(yù)處理