tau蛋白磷酸化在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用.pdf

1、【背景】
　　錳是一種機(jī)體必需的微量元素，但過(guò)多的錳進(jìn)入體內(nèi)則會(huì)產(chǎn)生毒性作用。錳的毒性作用主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，慢性錳中毒主要表現(xiàn)為錐體外系神經(jīng)功能障礙，類似于帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）的癥狀。
　　tau蛋白是微管相關(guān)蛋白家族的成員之一，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持微管功能等方面具有重要作用，多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中都出現(xiàn)了與tau蛋白相關(guān)的特征性病理改變。tau蛋白過(guò)度磷酸化可影響其正常功能，

2、引起一系列的病理?yè)p害。tau蛋白過(guò)度磷酸化后，其促微管聚合功能喪失，神經(jīng)元微管解體，易于聚集成雙螺旋絲（pairedhelicalfilaments，PHF）以及形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillarytangle，NFT）結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)變成為毒性分子，可結(jié)合神經(jīng)元中正常的微管相關(guān)蛋白，使微管結(jié)構(gòu)崩解，神經(jīng)元退變。
　　多種蛋白激酶系統(tǒng)參與了tau蛋白的磷酸化過(guò)程，其中PI3K/Akt/GSK-3β以及MAPK信號(hào)通路是近年

3、來(lái)研究tau蛋白磷酸化過(guò)程中涉及較多的兩個(gè)信號(hào)通路。此外，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為與神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白的磷酸化過(guò)程密切相關(guān)，而我們此前的研究證實(shí)，錳可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激水平的增高從而發(fā)揮其神經(jīng)毒性效應(yīng)。
　　【目的】
　　從細(xì)胞水平研究錳對(duì)神經(jīng)元tau蛋白磷酸化水平的影響及其在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用，并且從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化應(yīng)激的角度探討這個(gè)過(guò)程中的分子機(jī)制，從而為進(jìn)一步闡明錳神經(jīng)毒性的機(jī)制以及提出有效的錳神經(jīng)毒性防護(hù)措施提供新的思路

4、和理論依據(jù)。
　　【方法】
　?。?）利用培養(yǎng)的高分化型PC12細(xì)胞建立錳誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損傷的細(xì)胞模型。（2）MTT、LDH活性檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)、電鏡等檢測(cè)細(xì)胞毒性。（3）免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞骨架形態(tài)的變化。（4）WesternBlot技術(shù)檢測(cè)tau蛋白磷酸化水平以及相關(guān)信號(hào)通路的變化。（5）ROS水平檢測(cè)了解細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。
　　【結(jié)果】
　　1.錳對(duì)PC12細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)作用
　　MTT結(jié)果顯

5、示，隨著錳作用濃度的增高，PC12細(xì)胞活力逐漸下降。LDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著錳作用濃度的增高，PC12的損傷逐漸加重。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，錳可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率的顯著增高。電鏡檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)，錳染毒后PC12細(xì)胞可出現(xiàn)典型的凋亡超微結(jié)構(gòu)特征。
　　2.錳可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞骨架的改變
　　錳在誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的同時(shí)，也使細(xì)胞骨架形態(tài)出現(xiàn)了顯著改變。免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞骨架形態(tài)清晰，排列規(guī)則、有序，細(xì)胞突

6、起細(xì)長(zhǎng)。錳作用后，PC12細(xì)胞骨架形態(tài)模糊、崩解，失去原有的規(guī)則排列方式。細(xì)胞胞體變大，突起縮短、或者消失。同時(shí)，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂等變化。此外，錳誘導(dǎo)細(xì)胞骨架改變的程度與其作用濃度呈正相關(guān)。
　　3.錳誘導(dǎo)PC12細(xì)胞tau蛋白磷酸化水平的增高
　　在不同濃度錳（0、100、300、500μmol/L）作用相同時(shí)間（6h）后以及300μmol/L錳作用不同時(shí)間（0、0.5、1、3、6h）后，PC12細(xì)胞的tau蛋白在Se

7、r199、Ser202、Ser396和Ser404等位點(diǎn)均出現(xiàn)了磷酸化水平的增高。
　　4.錳誘導(dǎo)PC12細(xì)胞tau蛋白磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　研究結(jié)果顯示，錳可誘導(dǎo)ERKMAPK、PI3K/Akt以及GSK-3β的激活，抑制這些信號(hào)通路的激活均能夠抑制錳所誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化、細(xì)胞骨架的改變以及細(xì)胞損傷，而抑制ERKMAPK的激活還可抑制GSK-3β活性的增高，表明在這個(gè)過(guò)程中ERKMAPK可能在GSK-3β的上游。<

8、br>　　5.氧化應(yīng)激在錳誘導(dǎo)的tau蛋白過(guò)度磷酸化過(guò)程中的作用
　　錳可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的增高，表現(xiàn)為ROS水平的增高。而抗氧化劑NAC可抑制錳所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和tau蛋白的過(guò)度磷酸化。同時(shí)，細(xì)胞骨架的形態(tài)也有所改善。
　　【結(jié)論】
　　1.在誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖抑制以及損傷、凋亡的同時(shí)，錳可以誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白tau磷酸化水平的增高。tau的過(guò)度磷酸化可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的異常并進(jìn)一步

9、誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷。
　　2.錳所誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化過(guò)程受到蛋白激酶的調(diào)控，其中錳可通過(guò)激活ERKMAPK進(jìn)一步激活GSK-3β信號(hào)通路從而誘導(dǎo)tau蛋白的磷酸化，同時(shí)錳還可能通過(guò)誘導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)tau蛋白的過(guò)度磷酸化和相應(yīng)的細(xì)胞毒性。
　　3.錳可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激水平的增高并進(jìn)一步誘導(dǎo)tau蛋白的過(guò)度磷酸化。通過(guò)補(bǔ)充抗氧化劑有望成為抑制錳毒性的一個(gè)有效途徑。
　　綜上所述，我們的研究初