復合心肌組織工程聯(lián)合大網膜移植術治療心肌梗死的實驗研究.pdf

1、第一部分、可降解組織工程材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的制備及評價
　　 目的：采用電紡絲技術制備新型可降解材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)三維立體支架；通過掃描電鏡觀察支架超微結構；進行體外力學、降解性能及細胞相容性評價；進行皮下包埋，評價其組織相容性；初步探討其作為心肌組織工程支架應用的可行性。
　　 方法：
　　 1、PLGA三維支架的制備及超微觀察：PLGA電紡絲使用PLGA(50/50)顆粒，以氯

2、仿/DMF(體積比2:1)的混合溶液為溶劑，配成濃度分別為8％的溶液，溶液在室溫下攪拌過夜。紡絲時將聚合物溶液倒入30ml玻璃注射器中，選用8＃針頭，紡絲電壓為+10kV，接收距離為12cm，供料速率為3ml/h，接收裝置為上覆鋁箔的銅板。將獲取的紡絲樣品真空噴金后用掃描電鏡觀察其表面形貌，加速電壓為20 kV。
　　 2、對PLGA紡絲布片進行縫合強度、斷裂強度測試：將PLGA紡絲布片修剪成20mm×5mm的長方形(n=7)，

3、然后將其一端夾在拉力機的夾具中，另一端用4＃手術線與布片縫合在一起，測試其縫合強度；將PLGA布片修剪成工字形樣條(n=8)，兩端夾在拉力機的夾具中，測試范圍長20mm，寬2mm，厚約0.5mm，進行斷裂強度測試。
　　 3、PLGA紡絲布片的體外水解降解測試：將PLGA紡絲布片裁剪成尺寸約為10mm×10mm的正方形樣片(n=3×4)，去污、蒸餾水沖洗、干燥后稱重，然后放入6孔培養(yǎng)板內，加入PBS緩沖液完全浸潤樣片，放入37℃

4、恒溫箱內。在第1、2、4、6周之后將樣片取出，用去離子水沖洗樣片表面的鹽離子，然后在室溫下真空干燥至恒重，進行重量損失計算。
　　 4、PLGA紡絲布片的細胞相容性測試：以有機錫為穩(wěn)定劑的聚氯乙烯(PVC)為陽性對照組，將收集到的PVC、PLGA膜片修剪成10×10mm大小，進行沖洗、消毒，按照膜片表面積；浸提遞質=3 cm2:1ml的比例進行浸提液的制備。采用浸提液L929細胞培養(yǎng)MTT法進行細胞毒性測試、采用浸提液BrdU細

5、胞增殖法觀察細胞增殖情況、采用直接接觸培養(yǎng)法進行細胞形態(tài)學觀察。
　　 5、PLGA紡絲布片的體內組織相容性測試：將PLGA紡絲布片裁剪成尺寸約為10mm×10mm的樣片(n=3×3)，建立大鼠皮下包埋模型，分別于術后1、2、4周取出材料，進行組織切片HE染色，觀察材料變化情況。
　　 結果：
　　 1、PLGA紡絲布片絲形貌良好，尺寸較均勻，內部相互貫通，孔徑約100～150微米不等，孔隙豐富，分布均勻，適于營

6、養(yǎng)物質的交換及代謝產物的排出，能夠滿足種植細胞生長的需求。
　　 2、經體外力學測試PLGA電紡絲布片的縫合強度為(4.9±0.6)N，斷裂拉伸強度為(1.6±0.3)MPa，可以滿足心肌補片材料的力學要求。
　　 3、經重量損失計算發(fā)現(xiàn)PLGA紡絲布片在磷酸鹽緩沖液中水解降解6周后，質量損失為13.4％，而且從第4周開始支架的降解速度加快，此外我們還觀察到第8周時材料出現(xiàn)崩解，說明此PLGA支架具有可降解性。
　

7、　 4、細胞毒性測試PLGA材料細胞毒性穩(wěn)定在0～1級水平，對照組PVC組毒性穩(wěn)定在4級水平，表明PLGA材料毒性較小，有利于細胞生長；應用BrdU細胞增殖法觀察發(fā)現(xiàn)L929細胞從2～5天經歷了4天的快速DNA合成期，增殖情況良好。細胞形態(tài)學觀察顯示L929細胞在PLGA膜片上呈梭形或三角形伸展，貼壁良好，生長旺盛，提示該材料細胞相容性良好，符合組織工程心肌支架材料的應用要求。
　　 5、大鼠皮下包埋術后標本切片觀察支架材料符

8、合慢性炎癥反應過程，大鼠細胞向材料內部遷移、增殖，并沿紡絲纖維排列，第4周形成致密結構，組織相容性良好。
　　 結論：
　　 1、應用電紡絲技術制備的PLGA紡絲支架的微觀形貌良好，滿足心肌組織工程支架材料的幾何要求；
　　 2、PLGA紡絲支架具有良好的縫合強度和抗拉強度，滿足組織工程心肌支架材料的力學要求；
　　 3、PLGA紡絲支架具有可降解性，隨著時間的延長，其降解速度加快；
　　 4、P

9、LGA支架材料無明顯細胞毒性，細胞在浸提液中的增殖良好，細胞形態(tài)學觀察也證實該材料良好的細胞相容性；
　　 5、PLGA紡絲支架具有良好的組織相容性，體內置入未見明顯炎癥及排異反應，可安全得進行體內移植。
　　 第二部分、復合組織工程聯(lián)合大網膜移植術治療心肌梗死的在體實驗研究
　　 目的：缺血性心臟病具有很高的發(fā)病率和死亡率，心肌梗死后心肌細胞大量死亡，最終導致心力衰竭，對人類健康構成巨大威脅。內科藥物治療、冠脈

10、介入及外科手術雖能改善癥狀，但均有不足。細胞移植是一種很有前途的針對缺血性心臟病的治療手段，目前已有大量相關實驗報道，目前的細胞治療多采用注射方式，但其移植效率仍存在不足，急需尋找新的有效的治療手段和方法。新興的組織工程醫(yī)學為我們提供了新的思路：通過體外構建出可降解PLGA三維立體支架，在體外將骨髓間充質干細胞種植于支架材料上構建出復合組織工程移植物進行心外補片治療，提高細胞移植效率；針對移植后的血供缺陷，我們采用帶蒂大網膜包裹術(OP

11、)改善局部微環(huán)境，為移植物提供血運支持；通過建立大鼠心梗模型，評價上述治療措施對心肌梗死治療的療效，為將來心肌組織工程的臨床應用打下堅實的實驗基礎。
　　 方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠MSCs采用全骨髓差速貼壁培養(yǎng)法進行分離、培養(yǎng)，選取生長旺盛的第3代細胞進行體外DAPI標記，種植于PLGA支架上體外培養(yǎng)4天。選擇4周齡雌性SD大鼠，結扎左冠狀動脈前降支制作大鼠心肌梗死(Myocardial infarct

12、ion，MI)模型。心梗后1周，經胸心臟超聲篩選左室射血分數(shù)(LVEF)小于60％同時左室縮短分數(shù)(LVFS)小于30％的心梗鼠進行隨機分為4組，分別為MI對照組(n=10)、MSCs-PLGA組(n=12)、PLGA-OP組(n=12)及MSCs-PLGA-OP組(n=35)，進行二次開胸手術操作。MI對照組僅行二次開胸對照；MSCs-PLGA組單純行工程材料心梗區(qū)心外膜補片移植；PLGA-OP組行無細胞種植的PLGA補片心外膜移植復

13、合帶蒂大網膜包裹術；MSCs-PLGA-OP組行工程材料移植復合帶蒂大網膜包裹術。術后4周，應用超聲心動圖評價左心功能，標本取材做病理學檢測(HE染色、免疫組化染色及免疫熒光染色)。另外，MSCs-PLGA-OP組分別于術后1、2周各處死9只觀察MSCs隨時間變化的存活情況。
　　 結果：術后各組大鼠存活狀態(tài)良好，未見明顯副作用發(fā)生。超聲心動圖檢測顯示，與MI對照組(49.85％±5.03％&22.06％±2.78％)相比，MS

14、Cs-PLGA-OP組(59.68％±5.78％&27.65％±3.81％)及MSCs-PLGA組(56.89％±7.57％&26.22±4.55％)的EF和FS均有改善(p<0.05，ANOVA檢測)，而PLGA-OP組(55.46％±3.75％&25.28％±2.22％)心功能雖有改善趨勢，但無統(tǒng)計學意義；各組間的LVEDD和LVESD無統(tǒng)計學差異，說明PLGA紡絲支架富有彈性，未明顯影響心臟的舒縮功能。MSCs-PLGA-OP組術