VEGF對多巴胺能細胞的保護作用及VEGF基因治療帕金森病的實驗研究.pdf

1、第一部分、VEGF 對6-羥多巴胺誘導(dǎo)PC12 細胞損傷的保護作用
　　 目的：探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的PC12 細胞變性損傷的保護作用及機制。
　　 方法：用PC12 細胞制作帕金森病細胞模型，采用四甲基偶氮唑鹽法檢測暴露于梯度濃度VEGF165 后細胞的活性；流式細胞術(shù)檢測對照組、損傷組(單加6-OHDA)、VEGF組(單加VEGF165)和VEGF 保護組(同時加6-O

2、HDA和VEGF165)細胞凋亡率(每組5個樣本)；免疫印跡法檢測PC12 細胞VEGF165 及其受體fms樣酪氨酸激酶-1(Flt-1)、胎肝激酶-1(Flk-1)、神經(jīng)纖毛蛋白-1(Nrp-1)的表達，并觀察VEGF165 及其受體中和抗體對VEGF165作用的影響。
　　 結(jié)果：隨著VEGF165的濃度增加到50～100 ng/ml 時，PC12 細胞吸光度由0.14±0.06 逐步上升至0.35±0.08(P＜0.01

3、)，隨后又稍下降；細胞凋亡率VEGF 保護組(29.65[％]±6.63[％])低于損傷組(57.10[％]±5.66[％])，但高于VEGF組(3.67[％]±1.51[％])和對照組(4.76[％]±1.06[％])，P＜0.01；免疫印跡實驗檢測到PC12 細胞有VEGF165 及Flt-1和Nrp-1的表達，而未檢測到Flk-1；抗VEGF165和抗Nrp-1 中和抗體可阻斷VEGF165的作用，而抗Flt-1 抗體無作用。結(jié)論

4、VEGF165 可保護PC12 細胞因6-OHDA 造成的損傷，Nrp-1 受體在其中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分、腺病毒介導(dǎo)的VEGF165基因轉(zhuǎn)移保護6-羥多巴胺誘導(dǎo)的PC12 細胞損傷
　　 目的：探討腺病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)移對6-羥多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的多巴胺能細胞損傷的保護作用。
　　 方法：用腺病毒載體攜帶VEGF165基因(Ad-VEGF165)感染PC12 細胞，并

5、設(shè)腺病毒攜帶的β-半乳糖苷酶基因(Ad-LacZ)感染組和磷酸鹽緩沖液(PBS)處理組作對照，基因轉(zhuǎn)移成功后，用6-OHDA處理細胞，另加設(shè)不用6-OHDA處理的正常對照組。四甲基偶氮唑鹽法(MTT)測定細胞活性，免疫熒光細胞化學(xué)法檢測細胞酪氨酸羥化酶(TH)表達，高效液相色譜檢測細胞分泌功能。
　　 結(jié)果：腺病毒在30 MOI 以上感染強度時能高效感染PC12 細胞。Ad-VEGF165 感染組的PC12 細胞經(jīng)6-OHDA處

6、理后吸光度A570 (0.31±0.07)高于Ad-LacZ 感染組(0.15±0.07)和PBS處理組(0.13±0.05),但低于正常對照組細胞(0.55±0.10)，P<0.01；免疫熒光染色顯示Ad-VEGF組細胞胞漿平均熒光強度(86.75±21.62)高于Ad-LacZ組(51.53±17.49)及PBS組(54.19±15.82)，但低于正常對照組(110.39±24.21)(P<0.05)；Ad-VEGF感染組細胞培養(yǎng)液

7、中多巴胺和去甲腎上腺素含量也高于Ad-LacZ 感染組和PBS處理組。
　　 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的VEGF基因轉(zhuǎn)移對6-OHDA 誘導(dǎo)的多巴胺能細胞損傷具有保護作用。
　　 第三部分、腺病毒介導(dǎo)的VEGF基因轉(zhuǎn)移對帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護作用
　　 目的：探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)移對帕金森病(PD)大鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。
　　 方法：攜帶VEGF165基因的腺病毒(Ad-VEG

8、F165)載體感染大鼠一周后，紋狀體注射6-羥基多巴胺制作大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷的PD 模型。采用大鼠旋轉(zhuǎn)行為觀察、免疫組織化學(xué)方法和高效液相色譜技術(shù)檢測VEGF165基因轉(zhuǎn)移的PD大鼠行為學(xué)變化、黑質(zhì)紋狀體酪氨酸羥化酶(TH)、層粘蛋白(laminin)和膠質(zhì)纖維原性酸性蛋白(GFAP)的表達以及紋狀體區(qū)多巴胺(DA)及代謝產(chǎn)物含量變化。并與重組腺病毒載體(Ad-LacZ)組及磷酸鹽緩沖液(PBS)組進行比較。
　　 結(jié)果：A

9、d-VEGF165 成功感染PD大鼠并高表達目的基因和蛋白。感染Ad-VEGF165的大鼠獲得行為學(xué)改善，其黑質(zhì)和紋狀體TH 陽性細胞數(shù)和纖維密度與對側(cè)半球的比值(0.42±0.11和0.56±0.10)高于Ad-LacZ組(0.20±0.10和0.28±0.09)和PBS組(0.22±0.13和0.24±0.08)，P<0.01；紋狀體區(qū)血管和膠質(zhì)細胞數(shù)量均明顯增多；Ad-VEGF165 感染組大鼠紋狀體區(qū)DA及代謝產(chǎn)物含量與對側(cè)比值

10、也高于對照組。
　　 結(jié)論：Ad-VEGF基因轉(zhuǎn)移能保護PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元，血管和膠質(zhì)細胞的增生可能參與了VEGF 對在體多巴胺能神經(jīng)細胞的保護機制。
　　 第四部分、紋狀體內(nèi)VEGF基因轉(zhuǎn)移挽救帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元
　　 目的：觀察血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)移能否挽救帕金森病(PD)大鼠多巴胺能神經(jīng)元變性損傷。
　　 方法：先采用6-OHDA 注射制備紋狀體損傷的大鼠PD 模型，一周后，腺病毒載體

11、攜帶VEGF165基因(Ad-VEGF165)感染PD 模型大鼠紋狀體，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為及黑質(zhì)和紋狀體區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學(xué)變化。并與重組腺病毒載體(Ad-LacZ)組及磷酸鹽緩沖液(PBS)組進行比較。
　　 結(jié)果：腺病毒(Ad)感染PD大鼠后高表達目的基因和治療蛋白；Ad-VEGF165 感染組動物行為學(xué)獲得改善，同時其黑質(zhì)和紋狀體TH 陽性細胞數(shù)和纖維密度與對側(cè)半球的比值(0.34±0.13和0.38±0.14