低氧上調(diào)脂筏蛋白stomatin的表達(dá)，并增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素對(duì)其的誘導(dǎo)作用.pdf

1、在低氧時(shí)肺是最容易受到損傷的器官之一,肺水腫是低氧導(dǎo)致的嚴(yán)重結(jié)果,可危及生命,已知跨肺泡上皮的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙是肺水腫發(fā)生的重要機(jī)制之一。正常情況下,鈉從肺泡腔內(nèi)的上皮細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入血,引起水依滲透壓梯度吸收入血,這是肺泡液體吸收的主要機(jī)制。低氧能降低肺泡上皮屏障功能,抑制肺泡上皮鈉攝取和液體的清除,而外源性給予糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)能夠加速肺泡腔液體的重吸收和清除,因此在臨床上GC被用來有效治療嚴(yán)重的肺水腫。近

2、年來的研究表明GC能提高肺上皮細(xì)胞鈉通道(epithelial sodium channel,ENaC)的活性,但是GC如何調(diào)節(jié)ENaC活性的具體機(jī)制不詳。Stomatin是一種膜上的脂筏蛋白,該蛋白具有腳手架功能,推測能與多種膜蛋白,如離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)子、骨架蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等結(jié)合,并影響其功能。國外的研究表明stomatin在線蟲中的同系物MEC-2能夠增加鈉通道的開放,提示stomatin可能在GC調(diào)節(jié)ENaC方面發(fā)揮作用。本研究

3、采用real-time PCR和Western blot的方法,觀察了低氧單獨(dú)或與GC聯(lián)合作用對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和大鼠肺組織中stomatin表達(dá)的影響,以及這些變化和肺水腫發(fā)生的可能關(guān)系,以探討低氧應(yīng)激時(shí)stomatin的表達(dá)改變和可能的機(jī)制,為今后進(jìn)一步研究stomatin的生物學(xué)功能以及作為糖皮質(zhì)激素/糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)調(diào)節(jié)的靶蛋白在GC低氧適應(yīng)中的作用打下基礎(chǔ)。

4、 一、低氧、糖皮質(zhì)激素單獨(dú)或者聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞stomatin表達(dá)的影響 首先觀察了人工合成的糖皮質(zhì)激素-地塞米松(dexamethasone,Dex)對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)stomatin表達(dá)的影響。于含10％去激素血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的A549細(xì)胞中加入不同濃度Dex處理12h,或者用10nM濃度Dex處理細(xì)胞不同時(shí)間后,抽取細(xì)胞的RNA,用real-time PCR方法檢測stomatin mRNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dex能以時(shí)間

5、和濃度依賴的方式誘導(dǎo)stomatin mRNA的表達(dá),10nM濃度Dex處理細(xì)胞12h后,其stomatin mRNA的表達(dá)量約為對(duì)照細(xì)胞的4倍(p<0.01)。用Western blot的方法證實(shí)GC也能誘導(dǎo)A549細(xì)胞stomatin蛋白的表達(dá)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GR的阻斷劑RU486能明顯阻斷GC對(duì)stomatin表達(dá)的上調(diào)作用,表明GC對(duì)stomatin表達(dá)的影響是通過GR來實(shí)現(xiàn)的。接下來我們觀察了低氧對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)stomati

6、n mRNA和蛋白表達(dá)的影響。將生長密度為90％左右的A549細(xì)胞培養(yǎng)基換成含10％去激素血清的培養(yǎng)基,然后將細(xì)胞置于含有1％O2的低氧孵箱,在低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞不同時(shí)間后測定其stomatin mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧處理2h后stomatin mRNA就明顯上調(diào)(p<0.05),并隨著低氧時(shí)間的延長上調(diào)更明顯,低氧24h后stomatin mRNA的表達(dá)量約是對(duì)照組的3.4倍(p<0.01)。蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果表明低氧也能

7、以時(shí)間依賴的方式上調(diào)stomatin的表達(dá),低氧處理細(xì)胞4h后stomatin蛋白表達(dá)即開始上調(diào),低氧32h后stomatin蛋白的表達(dá)量增加更為明顯。 我們進(jìn)一步觀察了低氧、GC單獨(dú)或聯(lián)合作用12h對(duì)A549細(xì)胞stomatin mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氧、Dex單獨(dú)處理的A549細(xì)胞stomatin mRNA的表達(dá)量分別為對(duì)照組的2倍(p<0.05)、5倍(p<0.01),而二者聯(lián)合處理后stomatin mRNA的

8、表達(dá)則上升至對(duì)照組的7倍左右(p<0.01)。上述處理方式同樣能夠影響A549細(xì)胞stomatin蛋白的表達(dá),Dex單獨(dú)上調(diào)的作用強(qiáng)于低氧單獨(dú)作用的結(jié)果,而兩者共同處理后stomatin蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增多。 二、低氧和糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠肺組織stomatin表達(dá)的影響 將大鼠放入充有8％O2、92％N2混合氣的低氧艙內(nèi)低氧暴露不同時(shí)間,檢測大鼠肺組織stomatin mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示大鼠肺組織stomatin

9、 mRNA的表達(dá)在低氧處理8小時(shí)后即有上調(diào),約為對(duì)照組的1.7倍(p<0.05),之后逐漸降低,24h時(shí)接近對(duì)照組的水平。已有實(shí)驗(yàn)表明低氧暴露的動(dòng)物血中糖皮質(zhì)激素明顯增高,而我們上述實(shí)驗(yàn)已證明GC可誘導(dǎo)stomatin的表達(dá)。為了確定GC在機(jī)體上調(diào)stomatin表達(dá)的過程中發(fā)揮了多大的作用,我們摘取了大鼠的腎上腺以去除內(nèi)源性激素對(duì)stomatin表達(dá)的影響。我們先觀察了低氧12h正常大鼠的肺組織stomatin mRNA的變化,結(jié)果表

10、明stomatin mRNA的表達(dá)明顯增加,約為常氧組大鼠的2倍(p<0.01),但是當(dāng)?shù)脱踅M和常氧組大鼠均去腺后,這種表達(dá)差異變的不明顯。我們進(jìn)一步將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)常氧對(duì)照組、其余去腺后分為常氧組、低氧組、Dex組和低氧加Dex共處理組。對(duì)肺組織stomatin mRNA的檢測結(jié)果顯示,去腺常氧組大鼠stomatin mRNA的表達(dá)與假手術(shù)常氧對(duì)照組相比略有降低,但差別不明顯。去腺低氧組大鼠stomatin的mRNA與去腺常氧組大

11、鼠相比雖然輕度升高,但差別也不明顯。去腺Dex組大鼠肺組織stomatin mRNA的表達(dá)比單獨(dú)去腺組明顯增高,而去腺大鼠用Dex和低氧聯(lián)合處理,stomatin mRNA的表達(dá)增加更為明顯。表明在體內(nèi)低氧上調(diào)stomatin的表達(dá)依賴于Dex,而且低氧能明顯增強(qiáng)Dex上調(diào)stomatin的作用。 三、低氧對(duì)肺水腫發(fā)生的影響 觀察了低氧暴露不同時(shí)間后大鼠肺水腫發(fā)生的情況,并與stomatin的表達(dá)變化進(jìn)行了比對(duì),以初步探

12、討其表達(dá)與肺組織水腫發(fā)生之間可能的相關(guān)性。組織學(xué)的檢測結(jié)果顯示,低氧處理8h和16h的大鼠與對(duì)照大鼠相比肺血管明顯充血,肺泡間隔增寬,肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫液,證明低氧大鼠出現(xiàn)了肺水腫,低氧處理24h的大鼠肺水腫有所減輕。我們又檢測了判定大鼠肺水腫的另外兩個(gè)指標(biāo)一肺組織濕干比、肺系數(shù),結(jié)果表明與對(duì)照組相比,低氧8h組肺系數(shù)增高最明顯(p<0.05),16h、24h組有所降低,與組織學(xué)的檢查結(jié)果一致。另外,我們還發(fā)現(xiàn)低氧和Dex聯(lián)合處理組大鼠肺組

13、織stomatin的表達(dá)水平最高,而肺水腫的表現(xiàn)也最輕,提示stomatin的增多有減輕肺水腫的作用,推測stomatin有可能通過調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞的鈉通道促進(jìn)肺泡水腫液的清除,這方面還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證明。 綜上所述,低氧、糖皮質(zhì)激素都能上調(diào)A549細(xì)胞stomatin的表達(dá),糖皮質(zhì)激素的作用強(qiáng)于低氧,兩者聯(lián)合作用具有協(xié)同效應(yīng)。低氧也能明顯上調(diào)大鼠肺組織stomatin的表達(dá),該作用需要糖皮質(zhì)激素受體的存在,而且低氧能明顯增強(qiáng)D