低氧和糖皮質激素對GILZ表達的調節(jié)及其可能的機制.pdf

1、低氧導致的組織損傷與炎癥反應密切相關。已證實機體對缺氧損傷的習服與適應受糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)的影響。在低氧條件下分泌增多的GC能通過糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor,GR)的介導,調節(jié)基因表達,但是至今對于參與了低氧適應的糖皮質激素/受體(GC/GR)的靶基因還知之不多。糖皮質激素誘導的亮氨酸拉鏈蛋白(Glucocorticoid induced leucine zipper,G

2、ILZ)是近年來發(fā)現(xiàn)的GC/GR靶蛋白,因其具有與GC類似的免疫抑制、抗炎、抑制細胞增殖等功能,被認為是GC作用的重要介導子,因此我們推測GILZ有可能參與了GC對低氧的保護作用。迄今低氧對GILZ的表達是否影響尚未見報道。本課題采用Real-time PCR及Western blot方法研究了低氧以及低氧和GC聯(lián)合處理對大鼠脾臟和體外培養(yǎng)細胞中GILZ表達的影響,并初步探討了其機制,以進一步闡明GC對低氧適應的機制。 一、在體

3、低氧和GC協(xié)同上調GILZ的表達 首先在體觀察了低氧能否導致GILZ表達的改變。將250～300g的健康雄性SD大鼠放入低氧艙(8％O2、92％N2)內暴露不同時間,采用Real-time PCR及Western blot方法檢測大鼠脾和肺組織中GILZ的表達情況。結果發(fā)現(xiàn),大鼠低氧暴露8h,12h,24h,脾組織中GILZ mRNA和蛋白的表達與對照相比均明顯增加,其中低氧8 h大鼠GILZ mRNA表達水平最高,約為對照大鼠

4、的2.2倍(p<0.05)。低氧12h組肺組織中GILZ mRNA表達約為對照的1.5倍(p<0.05)。 為了觀察在體低氧上調GILZ是否受GC的影響,我們將大鼠隨機分為假手術組、去腺(雙側腎上腺切除)常氧組、去腺地塞米松(dexamethasone,Dex)組(肌注5mg/kg)、去腺低氧組、去腺Dex(5mg/kg)和低氧聯(lián)合處理組,不同處理12h后檢測脾組織GILZ的表達。結果顯示,單純去腺組GILZ mRNA降低至假手

5、術組的44％(p<0.01),給去腺大鼠肌注Dex處理后,其脾臟GILZ的mRNA水平明顯增高,約為去腺大鼠的13倍(p<0.01);去腺低氧組與單純去腺組相比GILz的mRNA變化不明顯,但去腺后Dex聯(lián)合低氧處理組大鼠脾組織中GILZ的mRNA表達顯著高于去腺低氧組,約為去腺低氧組大鼠的10倍(p<0.01),也明顯高于去腺Dex組,約為去腺Dex大鼠的1.4倍(p<0.05)。蛋白水平的實驗得到相似的結果。該實驗表明在體低氧上調G

6、ILZ的表達需要GC存在,而且低氧和GC能協(xié)同上調GILZ的表達。 二、GC能進一步提高低氧時大鼠脾臟HIF-1α蛋白的水平參與低氧反應 最重要的轉錄因子是低氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)。低氧可以明顯提高HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性,從而使其在細胞內的濃度升高。我們采用Western blot的方法觀察了大鼠在不同處理情況下HIF-1α蛋白水平的變化。 結果表明去

7、腺大鼠低氧暴露后,其脾臟HIF-1α的蛋白水平明顯增高。該實驗說明我們給予的低氧條件的確可以使大鼠處于低氧狀態(tài)。而去腺低氧聯(lián)合Dex組大鼠脾臟的HIF-1α蛋白進一步增多,表明糖皮質激素能進一步增強HIF-1α蛋白在低氧時的穩(wěn)定性,從而可能增強機體的組織細胞對低氧的適應性。 三、低氧和GC單獨或者協(xié)同上調RAW264.7細胞GILZ的表達 為了排除在體低氧導致的神經內分泌變化的影響,了解低氧是否可以直接影響GILZ的表達

8、,我們采用了體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞,將細胞放入低氧培養(yǎng)箱(1％O2)內不同時間,檢測GILZ的表達情況。結果顯示,與對照相比,低氧組GILZ mRNA水平在4h時先輕度降低,之后逐漸增高,12h達到最高,約為對照的2.7倍(p<0.01),24h回落但仍高于對照水平。Western blot結果表明GILZ蛋白表達在低氧處理8h時上調明顯,12h仍維持上調水平,表明低氧能夠直接上調小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞

9、中GILZ的表達。 在證實Dex能夠以時間依賴性的方式上調GILZ mRNA的表達的基礎上,進-步觀察了細胞分別給予低氧、Dex(100 nM)單獨或者聯(lián)合處理12小時,GILZ的表達情況。結果顯示,低氧和Dex可以單獨上調GILZ mRNA的表達,而GC和低氧聯(lián)合處理組GILZ mRNA表達比低氧和Dex單獨處理組都要明顯的高,蛋白水平的檢測結果顯示了類似的變化趨勢,表明GC和低氧在上調GILZ表達時二者有協(xié)同作用。

10、四、低氧上調GR的表達 上述實驗證明低氧不僅單獨可以上調GILZ的表達,而且可與Dex聯(lián)合作用協(xié)同上調GILZ的表達。為探討其機制,我們觀察了低氧單獨或者聯(lián)合Dex對GR表達的影響。結果顯示,低氧可上調RAW264.7細胞GR mRNA和蛋白的表達。對去腺大鼠的研究表明,去腺后低氧聯(lián)合Dex處理組脾組織中GRmRNA蛋白質的表達都比假手術組和去腺低氧組明顯增高。表明低氧可以通過上調GR從而增強GC誘導GILZ表達的作用。當然由于

11、GILZ啟動子上還存在有其他的轉錄因子反應元件,因此不排除在低氧條件下其他信號轉導通路激活的轉錄因子也參與了對GILZ表達的調節(jié)。 五、低氧對炎癥因子IL-1β表達的影響 有研究證實GILZ可以通過抑制NF-kB的轉錄活性從而發(fā)揮抑炎的作用,而促炎細胞因子IL-1β是NF-kB的靶基因。因此我們進一步觀察了低氧對RAW264.7細胞IL-1β mRNA表達的影響,以探討低氧上調GILZ與促炎細胞因子生成的關系。結果顯示,

12、RAW264.7細胞IL-1β mRNA表達低氧4h增加至對照的1.7倍(p<0.05),之后下降,12h約降至對照的40％(p<0.05)。IL-1mRNA表達變化的趨勢與低氧對GILZmRNA的表達調節(jié)趨勢正好相反,而大鼠低氧處理12h后脾組織IL-1βmRNA表達變化也與GILZ相反,提示低氧上調GILZ表達可能是低氧適應的機制之一,并與GC抑制低氧導致的炎癥反應密切相關。當然其確切的關系還需要進一步實驗來證明。 綜上所述

13、,對大鼠和體外培養(yǎng)的RAW264.7細胞的研究發(fā)現(xiàn)：低氧和GC單獨都可以上調GILZ mRNA和蛋白的表達,二者共同作用時具有協(xié)同效應,該作用與低氧能上調GR的表達有關,Dex還能進一步提高低氧時大鼠脾臟HIF-1α蛋白的水平,從而增強組織細胞對低氧的適應性。初步實驗還發(fā)現(xiàn)大鼠低氧暴露后GILZ的表達水平與IL-1β mRNA的表達程度呈負相關,推測低氧上調GILZ的表達是低氧適應的機制之一,并與GC抑制低氧導致的炎癥反應有關。以上結果