瘦素與雌激素在生長(zhǎng)板內(nèi)的相互作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分ATDC5細(xì)胞不同分化時(shí)期雌激素受體α、β及瘦素受體的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化
　　目的：瘦素受體和雌激素受體都可以在生長(zhǎng)板內(nèi)表達(dá),但是兩者的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律及共表達(dá)還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬利用ATDC5細(xì)胞株體外模擬生長(zhǎng)板軟骨性分化期和肥大性分化期等時(shí)間段軟骨細(xì)胞狀態(tài),觀察軟骨性分化標(biāo)志物Ⅱ型膠原和肥大性分化標(biāo)志物X型膠原的動(dòng)態(tài)變化,并觀察瘦素受體和雌激素受體在不同分化時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn),并探討這些變化之間的可能規(guī)律。
　　方法：

2、ATDC5細(xì)胞在ITS誘導(dǎo)下分化模擬軟骨內(nèi)骨化過(guò)程,阿爾新藍(lán)染色觀察染色強(qiáng)度;采用Realtime-PCR方法檢測(cè)4、7、14、21天不同分化時(shí)間點(diǎn)Ⅱ型和X型膠原、雌激素受體α、β及瘦素受體mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn);免疫熒光方法檢測(cè)瘦素受體分別和雌激素α、β受體是否存在共表達(dá)現(xiàn)象。
　　結(jié)果：ATDC5細(xì)胞在ITS誘導(dǎo)下呈現(xiàn)不同時(shí)期特征的分化特點(diǎn),阿爾新藍(lán)染色提示染色強(qiáng)度隨時(shí)間變化不斷增加,Realtime PCR結(jié)果提示,Ⅱ型膠原

3、在14天時(shí)表達(dá)最高,隨后顯著降低,x型膠原表達(dá)逐漸升高,至21天時(shí)表達(dá)最高;Erα和Erβ mRNA表達(dá)水平隨著細(xì)胞增殖分化過(guò)程逐漸升高,Erα在14天時(shí)達(dá)到高峰值,然后逐漸下調(diào);Erβ則一直緩慢升高,至21天時(shí)表達(dá)最高。而Obg mRNA的表達(dá)逐漸增加,21天時(shí)表達(dá)水平出現(xiàn)高峰值。Erα/Erβ的比值在4-14天之間趨于穩(wěn)定變化,隨后迅速減小。免疫熒光顯示ATDC5細(xì)胞內(nèi)ObR分別和Erα、Erβ都存在共表達(dá)現(xiàn)象。
　　結(jié)論：A

4、TDC5細(xì)胞分化過(guò)程中,在2周左右是軟骨細(xì)胞增殖期,在3周左右軟骨性肥大期特點(diǎn),雌激素受體α、β和瘦素受體在不同分化時(shí)期呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn),這可能雌激素、瘦素在不同分化時(shí)期介導(dǎo)不同作用的結(jié)果。
　　第二部分瘦素對(duì)ATDC5細(xì)胞內(nèi)雌激素α、β受體的調(diào)控及機(jī)制研究
　　目的：雌激素α、β受體可以在生長(zhǎng)板各層內(nèi)表達(dá),而且具有非配基調(diào)控的作用。瘦素可以調(diào)控生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖分化。瘦素對(duì)雌激素α、β受體的調(diào)控作用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬

5、利用ATDC5細(xì)胞株體外誘導(dǎo)至生長(zhǎng)板軟骨性增殖期,觀察瘦素對(duì)雌激素受體α、β的調(diào)控作用,并探討MAPK信號(hào)通路在瘦素調(diào)控作用過(guò)程中的可能機(jī)制。
　　方法：ATDC5細(xì)胞在ITS誘導(dǎo)分化下至14天,采用Realtime-PCR和westernblot方法檢測(cè)瘦素對(duì)雌激素受體α、β mRNA和蛋白的調(diào)控作用;用westernblot檢測(cè)瘦素對(duì)MAPK磷酸化作用,然后用U0126抑制MAPK磷酸化觀察瘦素對(duì)雌激素受體mRNA和蛋白的作用

6、。
　　結(jié)果：ATDC5細(xì)胞在ITS誘導(dǎo)至14天,瘦素50ng/ml作用48h后可以明顯上調(diào)雌激素受體α、β mRNA和蛋白的表達(dá)水平;而且瘦素對(duì)雌激素受體的作用呈劑量依賴(lài)效應(yīng);瘦素能增加ERK信號(hào)通路的磷酸化而且呈時(shí)間效應(yīng);采用U0126抑制ERK1/2信號(hào)通路能夠減弱瘦素對(duì)雌激素受體α、β mRNA和蛋白的上調(diào)作用。
　　結(jié)論：瘦素能上調(diào)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)雌激素受體α、β的表達(dá)水平,而且呈劑量依賴(lài)效應(yīng),瘦素可以增加ERK1

7、/2的磷酸化,瘦素對(duì)雌激素受體的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路完成的。
　　第三部分雌激素對(duì)ATDC5細(xì)胞內(nèi)瘦素受體的調(diào)控及機(jī)制研究
　　目的：雌激素在長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮基因組效應(yīng)和非基因組效應(yīng),其機(jī)制是通過(guò)雌激素受體和其他信號(hào)通路完成的。瘦素受體在生長(zhǎng)板各層內(nèi)表達(dá),雌激素對(duì)瘦素受體的調(diào)控作用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬利用ATDC5細(xì)胞株體外誘導(dǎo)至生長(zhǎng)板軟骨性分化期,觀察雌激素對(duì)瘦素受體的調(diào)控作用,并探討MAPK信號(hào)通

8、路在瘦素調(diào)控作用過(guò)程中的可能機(jī)制。
　　方法：ATDC5細(xì)胞在ITS誘導(dǎo)分化下至14天,采用Realtime-PCR和western blot方法檢測(cè)雌激素對(duì)瘦素受體mRNA和蛋白的調(diào)控作用,并觀察劑量依賴(lài)效應(yīng);并觀察雌激素α受體激動(dòng)劑PPT和β受體激動(dòng)劑DPN對(duì)瘦素受體mRNA和蛋白作用;用western blot檢測(cè)雌激素對(duì)MAPK磷酸化作用,然后用U0126和雌激素受體抑制劑ICI182.780抑制MAPK磷酸化和雌激素受體

9、觀察瘦素對(duì)雌激素受體mRNA和蛋白的作用;采用RNA干擾技術(shù)抑制α受體或者瘦素受體的表達(dá)觀察對(duì)應(yīng)受體的變化。
　　結(jié)果：ATDC5細(xì)胞在ITS誘導(dǎo)至14天,雌激素10-7M作用48h后可以明顯上調(diào)瘦素受體mRNA和蛋白的表達(dá)水平;而且雌激素對(duì)瘦素受體的作用呈劑量依賴(lài)效應(yīng),其有效劑量維持在較狹窄的范圍;相對(duì)于DPN,PPT對(duì)瘦素受體的調(diào)控作用更明顯;雌激素能增加ERK1/2信號(hào)通路的磷酸化而且呈時(shí)間效應(yīng);采用U0126抑制ERK1/

10、2信號(hào)通路以及ICI192.780抑制雌激素受體表達(dá)均能夠減弱雌激素對(duì)瘦素受體mRNA和蛋白的上調(diào)作用;雌激素α受體siRNA能抑制瘦素受體的蛋白表達(dá),瘦素受體siRNA能抑制Era受體的表達(dá)。
　　結(jié)論：雌激素能上調(diào)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞內(nèi)瘦素受體的表達(dá)水平,而且呈劑量依賴(lài)效應(yīng),雌激素α受體發(fā)揮主導(dǎo)作用,雌激素能增加ERK1/2的磷酸化,其對(duì)瘦素受體的調(diào)控機(jī)制是依賴(lài)雌激素受體和ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路完成的。雌激素旺受體與瘦素受體之間存