甲氨蝶呤聚酰胺—胺樹枝狀聚合物納米給藥系統(tǒng)的腫瘤靶向研究.pdf

1、聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(Polyamidoaminedendrimer,PAMAM)是一類應用廣泛的納米級樹枝狀大分子材料。它具有確切的組成與三維結(jié)構(gòu),分子量單一,無免疫原性,在使用劑量范圍內(nèi)無毒性.這些特點,使PAMAM在藥物傳釋系統(tǒng)研究中,具有獨特的研究價值。利用PAMAM內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu),可以包埋生物活性分子;通過化學反應則能夠使生物活性分子或靶向基團與PAMAM表面高密度的官能團相連接,構(gòu)筑一種納米級的給藥系統(tǒng)。MTX是干擾核酸合成

2、的抗代謝藥物,在惡性腫瘤的化療過程中被廣泛運用。但由于MTX臨床上應用時間較長,不少癌細胞對它已產(chǎn)生耐藥性,而且不良反應較多,因此其臨床應用受到越來越多的限制。本研究采用第四代(G4)和第五代(G5)PAMAM樹枝狀聚合物作為抗腫瘤藥物納米載體,以甲氨蝶呤為模型藥物,一方面通過靜電作用最大限度地將甲氨蝶呤復合于PAMAM表面,制備載體/藥物復合物;另一方面通過化學反應將甲氨蝶呤共價連接于PAMAM表面,構(gòu)建載體-藥物偶聯(lián)物,并利用PEG

3、(5000Da)對偶聯(lián)物進行結(jié)構(gòu)修飾。從而延長甲氨蝶呤的生物半衰期并通過EPR效應增加藥物在腫瘤組織的富集。為樹枝狀聚合物應用于藥物傳釋系統(tǒng)提供理論和實驗基礎(chǔ)。本文制備了PAMAM/MTX復合物,考察攪拌時間及制備介質(zhì)pH對MTX復合量的影響,確定攪拌時間為2h,制備介質(zhì)為去離子水。每分子的PAMAMG4和PAMAMG5分別最多能復合22、41個MTX分子。復合物的體外釋藥研究顯示其在10mMTris-HCl(pH7.4)緩沖液中,12

4、0h累積釋放百分率不超過65％:但釋放介質(zhì)的離子強度影響復合物中藥物的體外釋放,在含有0.15MNaCl的Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中,6h的累積釋放百分率超過90%。采用不同投料比合成PAMAM-PEG,其中PAMAMG4-PEG連接的PEG分子數(shù)分別為11、21、29,PAMAMG5-PEG連接的PEG分子數(shù)分別為16、30、37。經(jīng)過PEG修飾的PAMAM對紅細胞的溶血作用和KB細胞的細胞毒性均有所降低。在制備PAMAM

5、/MTX復合物的基礎(chǔ)上,同法制備PAMAM-PEG/MTX復合物,每分子PAMAMG4-PEG11、PAMAMG4-PEG21、PAMAMG4-PEG29分別最多能復合34、45和77個MTX分子,每分子PAMAMG5-PEG16)、PAMAMG5-PEG30、PAMAMG5-PEG37分別最多能復合53、122和140個MTX分子。PAMAM-PEG/MTX復合物在低離子強度的介質(zhì)中具有一定的緩釋作用,但隨著釋放介質(zhì)離子強度的增大,緩

6、釋作用減弱甚至消失。穩(wěn)定性實驗表明,PAMAM/MTX及PAMAM-PEG/MTX復合物在冰箱(3-5℃)及室溫(20-25℃)條件下儲存3個月,外觀基本保持不變,MTX含量略有下降,釋放行為與放置前基本一致。建立了反相高效液相色譜法測定血漿中甲氨蝶呤的含量,高氯酸直接沉淀法處理血漿樣品,回收率和精密度均符合要求。PAMAM/MTX和PAMAM-PEG/MTX復合物經(jīng)大鼠單劑量尾靜脈注射給藥后,t1/2和AUC較注射劑組顯著延長(p<0

7、.01),其中PAMAMG4/MTX、PAMAMG5/MTX復合物的t1/2分別為原藥組的1.86、1.94倍,AUC為原藥組的1.31、1.72倍;PAMAMG4-PEG11/MTX、PAMAMG4-PEG21/MTX、PAMAMG4-PEG29/MTX復合物的t1/2分別為原藥組的2.00、2.07、2.06倍,AUC為原藥組的2.03、2.29、2.43倍;PAMAMG5-PEG16/MTX、PAMAMG5-PEG30/MTX、P

8、AMAMG5-PEG37/MTX復合物的t1/2分別為原藥組的2.07、2.20、2.52倍,AUC為原藥組的2.81、4.19、4.99倍。合成了PAMAM-MTX及PEG-PAMAM-MTX偶聯(lián)物,采用核磁共振及紅外光譜等手段進行了結(jié)構(gòu)表征,1H-NMR分析顯示平均每分子PAMAM連接36分子MTX和8分子PEG。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法),考察了兩種偶聯(lián)物對KB細胞的細胞毒性,與原藥相比,偶聯(lián)物對KB細胞的殺傷作用顯著降

9、低。其中,PAMAMG4-MTX、PEG-PAMAMG4-MTX偶聯(lián)物及MTX的IC50值分別為24.8、29.9、5.3μM。大鼠單劑量尾靜脈注射125I標記的兩種偶聯(lián)物,發(fā)現(xiàn)其具有明顯的長循環(huán)作用。其中,在PAMAM-MTX及PEG-PAMAM-MTX大鼠體內(nèi)生物半衰期分別為20.58、24.93h,較原薊(1.12h)顯著延長(p<0.01),AUC分別為70.16、135.80μg-h/mL,較原藥(7.20μg-h/mL)顯著