地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞成骨特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙囊是牙齒萌出前的牙胚中圍繞造釉器和牙乳頭的疏松外胚間充質(zhì)組織。牙囊中含有形成牙周組織的前體細(xì)胞，在牙齒的發(fā)育過(guò)程中形成牙骨質(zhì)、牙周膜和固有牙槽骨。目前認(rèn)為牙囊靠近發(fā)育中的牙根的最內(nèi)層發(fā)育為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，形成牙骨質(zhì)；靠近牙槽骨的外層細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)；中間層發(fā)育為成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生牙周膜的細(xì)胞外基質(zhì)。由生長(zhǎng)因子和細(xì)胞分子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制牙囊細(xì)胞的發(fā)育和功能。牙骨質(zhì)的形成依靠牙根的形成，牙根形成開(kāi)始于內(nèi)釉上皮和外釉上皮增殖形成的

2、Hertwig's上皮根鞘，來(lái)源于上皮根鞘的刺激開(kāi)始了牙囊前體細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化。這些刺激物包括釉基質(zhì)蛋白、層粘連蛋白、I型膠原和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族等。 目前對(duì)于牙囊細(xì)胞的成骨特性研究集中于以下方面：1.體外培養(yǎng)培養(yǎng)牙囊細(xì)胞在體外的礦化和和體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)研究以及在此過(guò)程中的相關(guān)基因表達(dá)；2.胰島素、地塞米松和BMP-2誘導(dǎo)下牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，OCN、BMP-2、Cbfa1、DLX-5、MSX-2等基因的mRNA

3、的表達(dá)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)成骨細(xì)胞有影響的因素，其中包括多種生長(zhǎng)因子如：骨形成蛋白(BMPs)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，它們?cè)诖龠M(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)等方面起重要作用。在成骨細(xì)胞的分化過(guò)程中，與成骨相關(guān)的基因如骨鈣蛋白、骨涎蛋白、膠原等的表達(dá)也相應(yīng)發(fā)生變化。因此，研究牙囊細(xì)胞在成骨分化

4、的過(guò)程中，哪些因子參與了其中的過(guò)程，以及在分化過(guò)程中哪些基因發(fā)生變化都是非常重要的。本研究應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、基因芯片以及PCR等實(shí)驗(yàn)方法研究地塞米松對(duì)人牙囊細(xì)胞體外礦化的影響、地塞米松對(duì)人牙囊細(xì)胞中與成骨相關(guān)的96個(gè)基因表達(dá)的變化，初步探討人牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程的機(jī)制，為進(jìn)一步研究牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的研究提供基礎(chǔ)。本研究的內(nèi)容如下： 1.人牙囊細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 目的：探討人牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)的新方法，為進(jìn)一步研究

5、牙囊細(xì)胞的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。方法：取自12-13歲患者因正畸需要拔除的下頜第三磨牙牙冠以下部分的牙囊，采用組織塊和酶消化相結(jié)合的方法體外培養(yǎng)原代牙囊細(xì)胞，并對(duì)牙囊細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：接種72h可見(jiàn)經(jīng)消化松散貼壁的組織塊周?chē)屑?xì)胞呈放散狀爬出，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，組織塊周?chē)?xì)胞亦生長(zhǎng)旺盛。培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞生長(zhǎng)爬滿(mǎn)需要14天左右。培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞呈梭形、紡錘形或多角形，具有成纖維細(xì)胞特性。波絲蛋白細(xì)胞染色陽(yáng)性。結(jié)論：組織塊酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞，

6、細(xì)胞易于爬出，提高了培養(yǎng)的速度。 2.地塞米松對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖的影響 目的：探討地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞增殖的影響，為進(jìn)一步研究地塞米松對(duì)人牙囊細(xì)胞的作用奠定基礎(chǔ)。方法：在培養(yǎng)液中加入不同濃度的的地塞米松(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)，用四唑鹽(MTT)比色法觀察地塞米松對(duì)人牙囊細(xì)胞增殖影響的濃度效應(yīng)，用10-8mol/L地塞米松作用于人牙囊細(xì)胞，用MTT法觀察地塞米松對(duì)牙囊細(xì)

7、胞增殖的時(shí)間效應(yīng)。結(jié)果：1.10-10、10-9mol/L的地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響(P＜0.01)，而10-8、10-7、10-6mol/L的地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞的增殖有抑制作用(P＜0.01)。2.10-8mol/L地塞米松作用于牙囊細(xì)胞，牙囊細(xì)胞的增殖隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，其生長(zhǎng)曲線(xiàn)仍呈上升趨勢(shì)。結(jié)論：低濃度的地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，高濃度的地塞米松抑制牙囊細(xì)胞的增殖。10-8mol/L地塞米松作用于牙囊細(xì)胞，牙囊

8、細(xì)胞的增殖隨時(shí)間逐漸升高。 3.地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞中堿性磷酸酶活性和體外礦化的的影響 目的：觀察不同濃度的地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞體外分化的影響。方法：以不同濃度(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的地塞米松作為誘導(dǎo)劑，進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)。用含有10-8mol/L地塞米松、50mg/LL-抗壞血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的條件培養(yǎng)液長(zhǎng)期培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞

9、，觀察對(duì)體外礦化的影響。結(jié)果：1.10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的地塞米松增強(qiáng)牙囊細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)，與空白對(duì)照組均有顯著性差異，隨著地塞米松濃度的增加，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，不同濃度間具有顯著性差異(P＜0.05)。10-8mol/L的地塞米松作用于牙囊細(xì)胞，其堿性磷酸酶的表達(dá)，從第3天開(kāi)始升高，第7、9天達(dá)到最高。2.牙囊細(xì)胞在條件礦化液中培養(yǎng)4周，產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)。結(jié)論：地塞米松能夠升高體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞的堿性磷酸

10、酶的活性，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，10-8mol/L地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性；牙囊細(xì)胞在體外具有礦化能力。 4.地塞米松對(duì)人牙囊細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響 目的：檢測(cè)人牙囊細(xì)胞在體外條件下向成骨細(xì)胞分化時(shí)生長(zhǎng)因子及成骨相關(guān)基因表達(dá)的變化，初步探討牙囊細(xì)胞體外分化的機(jī)制。方法：牙囊細(xì)胞用含10-8mol/L地塞米松的培養(yǎng)液長(zhǎng)期體外培養(yǎng)4周，對(duì)照組不加地塞米松。然后用基因芯片技術(shù)檢

11、測(cè)地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞中成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果：地塞米松作用后的牙囊細(xì)胞中，有28個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，其中20個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，8個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。它們分別屬于生長(zhǎng)因子和相關(guān)蛋白、基質(zhì)和相關(guān)蛋白，細(xì)胞粘附分子未見(jiàn)明顯變化。結(jié)論：地塞米松能改變?nèi)搜滥壹?xì)胞中28個(gè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。 5.基因芯片的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證 目的：初步驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的可靠性。方法：人牙囊細(xì)胞用含10-8mol/L地塞米松的培養(yǎng)液長(zhǎng)期體外

12、培養(yǎng)4周，對(duì)照組不加地塞米松。然后用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞中OCN、BMP-2、Smad7mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：地塞米松作用后的牙囊細(xì)胞中OCN、BMP-2mRNA的表達(dá)上調(diào)，Smad7mRNA的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)初步證明了基因芯片技術(shù)的可靠性。 6.地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞中OCN、Cbfa1mRNA表達(dá)的影響 目的：探討Cbfa1在牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用。方

13、法：用含10-8mol/L地塞米松的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)牙囊細(xì)胞0、7、14、21、28天。對(duì)照組不加地塞米松。然后用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞中Cbfa1、OCNmRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：地塞米松作用后的牙囊細(xì)胞中Cbfa1mRNA的表達(dá)從第7天開(kāi)始升高，第14天達(dá)到最高水平，第21、28天逐漸降低；OCNmRNA的表達(dá)從第14天開(kāi)始升高，到28天明顯升高。結(jié)論：Cbfa1在啟動(dòng)人牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中發(fā)揮了