自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜微循環(huán)的改變及內(nèi)皮細胞對血管鈣化的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、第一部分自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜微循環(huán)的改變
　　目的:
　　動態(tài)監(jiān)測并定量分析不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensiverats，SHR)腸系膜微靜脈內(nèi)白細胞流變特性、真毛細血管內(nèi)紅細胞流動速度、肥大細胞脫顆粒及微血管迂曲度的變化。
　　方法:
　　取3、8和13周齡的雄性SHR和Wistar大鼠，使用活體顯微鏡動態(tài)監(jiān)測腸系膜微靜脈中白細胞流變特性、真毛細血管內(nèi)紅細胞流速、肥大

2、細胞脫顆粒及微血管迂曲度的變化。運用VasTrack自動測量系統(tǒng)對動態(tài)視頻錄像進行定量和分析。
　　結(jié)果:
　　(1)白細胞流變特性的改變:3周齡的SHR與Wistar大鼠的微靜脈內(nèi)白細胞滾動速度、滾動的白細胞數(shù)及微靜脈內(nèi)白細胞-內(nèi)皮接觸時間均無顯著差異。然而，與同周齡的8周齡和13周齡的Wistar大鼠相比，SHR的微靜脈內(nèi)白細胞滾動速度明顯加快（8周齡:72.73±36.12μm/s vs36.09±23.39μm/s，

3、P＜0.01;13周齡:81.33±24.37μm/s vs35.89±11.37μm/s，P＜0.01），滾動的白細胞數(shù)明顯減少（8周齡:41.38±21.79 cells/min vs60.83±28.87 cells/min，P＜0.01;13周齡:38.73±22.79 cells/min vs56.33±29.54 cells/min，P＜0.01），白細胞-內(nèi)皮接觸時間明顯延長（8周齡:142.67±27.51 s/min·

4、100μm vs116.24±17.33 s/min·100μm，P＜0.01;13周齡:327.29±56.44 s/min·100μmvs150.34±35.81 s/min·100μm，P＜0.01）。而且，隨著SHR周齡的增大，微靜脈內(nèi)滾動的白細胞數(shù)逐漸增多、白細胞-內(nèi)皮接觸時間逐漸延長。(2)真毛細血管內(nèi)紅細胞流速:3周齡的SHR和Wistar大鼠的真毛細血管內(nèi)紅細胞流速沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。8周齡時，SHR的流速明顯高于同周

5、齡的Wistar大鼠（1402±684μm/s vs982±560μm/s，P＜0.01）。然而，13周齡時，SHR的流速又低于同周齡的Wistar大鼠（874±335μm/svs1153±617μm/s，P＜0.05）。(3)肥大細胞脫顆粒:3周齡的Wistar大鼠與SHR的腸系膜內(nèi)，肥大細胞計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。對于8周齡和13周齡的大鼠，SHR的肥大細胞計數(shù)明顯多于Wistar大鼠（8周齡:10.51±3.8 vs8.4±2.2，P＜

6、0.01;13周齡:15.6±3.8 vs10.13±3.3，P＜0.01）。而且，8周齡和13周齡的SHR腸系膜內(nèi)的肥大細胞明顯要比3周的多。與同周齡的Wistar大鼠比，SHR腸系膜內(nèi)脫顆粒肥大細胞的百分比都升高（3周齡:75％±14％ vs25％±18％，P＜0.01;8周齡:83％±9％ vs33％±8％，P＜0.01;13周齡:90％±4％ vs46％±20％，P＜0.01）。而且隨著周齡增大，血壓增高，SHR腸系膜內(nèi)脫顆粒的

7、肥大細胞比例也在增加。(4)微血管迂曲度:與同周齡的Wistar大鼠相比，3、8、13周齡的SHR腸系膜內(nèi)微動脈迂曲度，均無統(tǒng)計學(xué)差異。而對于微靜脈迂曲度，僅3周齡SHR比同周齡的Wistar大鼠迂曲度大（1.83±0.49 vs1.29±0.16，P＜0.01），其余周齡均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　隨著高血壓進展，白細胞滾動速度加快、滾動的白細胞數(shù)量減少、白細胞-內(nèi)皮接觸時間延長;真毛細血管的紅細胞流速先代償性增

8、高、后失代償而降低;微血管周圍肥大細胞數(shù)量增加、脫顆粒細胞百分比增大;微血管的迂曲度增高主要發(fā)生于高血壓早期的微靜脈。
　　第二部分內(nèi)皮細胞對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈平滑肌細胞鈣化的促進作用及其機制的研究
　　目的:
　　探討內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)主動脈平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)鈣化中的促進作用及其機制。
　　方法:

9、r>　　原代分離和培養(yǎng)8周齡的Wistar大鼠和SHR主動脈SMCs和ECs，并以形態(tài)學(xué)特征以及α-SMA和vWF免疫熒光鑒定。將每一種屬的SMCs和ECs分為三組，分別用于共培養(yǎng)SMCs和ECs、以ECs的培養(yǎng)基條件培養(yǎng)SMCs、以及未進行任何處理的對照培養(yǎng)。6d后，以von Kossa染色和鈣定量分析SMCs的鈣沉積程度，以堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活力分析SMCs成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化程度，以We

10、stern blot分析BMP2、Runx2、Msx2、MMP-2、MMP-9、OPN、MGP在SMCs的表達水平變化，以及BMP2、MMP-2、MMP-9、OPN、MGP在ECs的表達水平變化情況。
　　結(jié)果:
　　(1)成功分離培養(yǎng)Wistar大鼠和SHR主動脈的SMCs(rat aortic smoothmuscle cells，RASMCs)和ECs（rat aortic endothelial cells，RAEC

11、s），經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫熒光鑒定后，細胞無混雜，無其它細胞污染。(2)鈣沉積改變:當(dāng)RASMCs與RAECs共培養(yǎng)6d后，與對照組相比，SHR RASMCs的細胞外鈣沉積明顯增加（鈣含量:58.38±7.95μg/mg protein vs24.30±3.22μg/mg protein，P＜0.01），用ECs培養(yǎng)基條件培養(yǎng)SMCs時，SHR RASMCs的鈣化程度依然要比對照組高（鈣含量:30.15±5.42μg/mg protein v

12、s24.30±3.22μg/mg protein，P＜0.01），而WistarRASMCs在共培養(yǎng)和條件培養(yǎng)時均無統(tǒng)計學(xué)意義的變化。(3)ALP活力的改變:當(dāng)RAECs與RASMCs共培養(yǎng)6d后，SHR RASMCs的ALP活力明顯高于對照組（106.28±16.63 unit/mg protein vs75.87±6.06 unit/mg protein，P＜0.01），而且當(dāng)RASMCs用RAECs的培養(yǎng)基條件培養(yǎng)時，SHR RA

13、SMCs的ALP活力（86.73±9.15unit/mg protein)依然比對照組高（P＜0.05）。然而，共培養(yǎng)和條件培養(yǎng)的WistarRASMCs的ALP活力改變卻無統(tǒng)計學(xué)意義。(4) BMP2、Runx2、Msx2的表達水平變化:共培養(yǎng)6d后，SHR RASMCs中BMP2、Runx2和Msx2的表達水平（相對于對照表達水平的倍數(shù)）顯著高于Wistar RASMCs（BMP2:2.88±0.12 foldvs1.43±0.21

14、 fold,P＜0.01;Runx2:1.76±0.09 fold vs1.26±0.08 fold,P＜0.01;Msx2:3.10±0.45 fold vs1.53±0.48 fold, P＜0.01）。而且當(dāng)SHR RASMCs以SHR RAECs培養(yǎng)基進行條件培養(yǎng)時，這些蛋白的表達水平依然要比Wistar RASMCs高(BMP2:1.84±0.37 fold vs1.22±0.22 fold, P＜0.05; Runx2:1.

15、39±0.02 fold vs1.07±0.13fold,P＜0.05; Msx2:1.94±0.34 fold vs1.26±0.19 fold,P＜0.01)。與SMCs共培養(yǎng)6d后，SHR RAECs中BMP2的表達水平也明顯高于Wistar RAECs（3.03±0.52 fold vs1.19±0.29 fold，P＜0.01）。(5)MMP-2和MMP-9表達水平的變化:無論共培養(yǎng)還是條件培養(yǎng)，MMP-2和MMP-9在SHR

16、 RASMCs中的表達水平與Wistar RASMCs相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但在SHR RAECs的表達水平卻明顯高于Wistar RAECs（MMP-2:2.18±0.48 fold vs1.38±0.38 fold，P＜0.01;MMP-9:1.84±0.40 fold vs1.16±0.21 fold，P＜0.01）。(6) OPN和MGP表達水平的變化:當(dāng)共培養(yǎng)6d以后，OPN和MGP在SHR RASMCs的表達水平明顯高于W

17、istar RASMCs(MGP:3.13±0.51 fold vs1.51±0.37 fold,P＜0.01;OPN:1.91±0.16fold vs1.56±0.23 fold, P＜0.05)。而且它們在SHR RAECs的表達水平也明顯高于Wistar RAECs(MGP:2.33±0.34 fold vs1.26±0.48 fold,P＜0.01;OPN:1.74±0.09fold vs1.28±0.32 fold,P＜0.0