自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的改變及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑減輕血管鈣化的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的改變
　　目的：
　　動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)并定量分析不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)。
　　方法：
　　取3周、8周和13周的雄性Wistar大鼠和SHR，麻醉、固定并暴露腸系膜后，在活體顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腸系膜微淋巴管的自律運(yùn)動(dòng)并錄像，運(yùn)用VasTrack自動(dòng)測(cè)量系統(tǒng)對(duì)錄像進(jìn)行定量和分析。分析的指標(biāo)包括微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的相對(duì)振幅、頻率、收縮期及舒張

2、期的幅度、時(shí)長(zhǎng)和速度，并根據(jù)頻率、最大舒張管徑和最大收縮管徑計(jì)算出腸系膜微淋巴管收縮功能的兩個(gè)指標(biāo):收縮分?jǐn)?shù)和總收縮活性指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　(1)SHR與Wistar大鼠腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)在不同周齡的差別:3周齡SHR與3周齡Wistar大鼠微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)在各個(gè)指標(biāo)方面均無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。到8周齡時(shí)，SHR微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的相對(duì)振幅、收縮幅度、收縮時(shí)長(zhǎng)、收縮速度、舒張幅度、舒張速度及總收縮活性指數(shù)均顯

3、著低于Wistar大鼠（分別為P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），SHR微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的頻率、舒張時(shí)長(zhǎng)和收縮分?jǐn)?shù)與Wistar大鼠無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。到13周齡時(shí)，SHR微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的相對(duì)振幅、收縮幅度、收縮時(shí)長(zhǎng)、舒張幅度、舒張時(shí)長(zhǎng)和收縮分?jǐn)?shù)顯著低于Wistar大鼠（均為P＜0.001），頻率和舒張速度顯著高于Wistar大鼠（均為P＜0.05），收縮

4、速度和總收縮活性指數(shù)與Wistar大鼠無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。(2) SHR腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)在不同周齡的差別:與3周齡SHR相比，8周齡SHR淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的相對(duì)振幅、頻率、舒張幅度、舒張速度和總收縮活性指數(shù)顯著降低（分別為P＜0.05, P＜0.05, P＜0.05, P＜0.01，P＜0.01）。8周齡SHR的收縮幅度、收縮時(shí)長(zhǎng)、收縮速度、舒張時(shí)長(zhǎng)和收縮分?jǐn)?shù)與3周齡SHR相比，均無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。13周齡

5、SHR的收縮頻率、收縮速度、舒張速度和總收縮活性指數(shù)均顯著高于8周齡SHR（分別為P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）;13周齡SHR的收縮時(shí)長(zhǎng)、舒張時(shí)長(zhǎng)和收縮分?jǐn)?shù)均顯著低于8周齡SHR（分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）;13周齡SHR的相對(duì)振幅、收縮幅度和舒張幅度與8周齡SHR相比，均無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　(1) SHR與Wistar大鼠的腸系膜微淋巴管均存在

6、自律運(yùn)動(dòng)。(2)高血壓可能是引起SHR腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)障礙的一個(gè)重要因素。(3)高血壓發(fā)生后，SHR腸系膜微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的舒張期活動(dòng)減弱，收縮功能顯著下降。(4)高血壓進(jìn)展過程中，SHR微淋巴管自律運(yùn)動(dòng)的紊亂體現(xiàn)在收縮功能增強(qiáng)，而收縮功能增強(qiáng)更有利于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。
　　第二部分基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑通過下調(diào)BMP-2抑制大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化
　　目的：
　　探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在血管鈣化中的

7、作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　取8周齡雄性Wistar大鼠，貼塊法培養(yǎng)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，形態(tài)學(xué)和免疫熒光法鑒定VSMCs。對(duì)照組的VSMCs采用DMEM培養(yǎng)基，鈣化組用β-甘油磷酸(β-GP)誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生鈣化，MMPs抑制劑組用β-GP+MMPs抑制劑多西環(huán)素(doxycycline，Doxy)。培養(yǎng)12天后，對(duì)VSMCs進(jìn)行von kossa染色和鈣含量分析，以檢測(cè)VSMCs鈣化。用試劑盒檢測(cè)堿性

8、磷酸酶(ALP)活性，用Westernblot檢測(cè)α-SMA，Desmin及ALP的蛋白表達(dá)，以觀察VSMCs表型改變。Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平，明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2、MMP-9的酶活性，以觀察MMPs抑制劑多西環(huán)素的抑制效果。Western blot檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)及其受體、RUNX2、Msx-2的表達(dá)水平，以探討MMPs抑制后BMP-2通路的變化。用TUNEL法檢測(cè)VSM

9、Cs凋亡狀況，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)，caspase-3活性試劑盒檢測(cè)caspase-3活性。
　　結(jié)果：
　　(1)培養(yǎng)的細(xì)胞鏡下呈梭形、紡錘形或菱形，細(xì)胞有多個(gè)突起，胞漿豐富，12天后，細(xì)胞出現(xiàn)“峰和谷”樣的生長(zhǎng)模式。平滑肌α-actin(smooth muscleα-actin，SMα-actin)抗體免疫熒光染色后，可見

10、胞漿呈綠色熒光，胞漿內(nèi)見大量與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMCs。(2)鈣化組的鈣含量和鈣化面積顯著高于對(duì)照組(P＜0.001，P＜0.001); MMPs抑制劑組的鈣含量和鈣化面積顯著低于鈣化組(P＜0.001，P＜0.001)。鈣化組可見VSMCs表型改變，而MMPs抑制導(dǎo)致VSMCs表型改變減輕。(3) Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與鈣化組相比，MMPs抑制導(dǎo)致MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)降低(P＜0.

11、01，P＜0.01);明膠酶譜檢測(cè)結(jié)果表明，與鈣化組相比，MMPs抑制導(dǎo)致MMP-2和MMP-9酶活性降低(P＜0.01，P＜0.01)。(4) MMPs抑制導(dǎo)致BMP-2、RUNX2和Msx-2蛋白表達(dá)降低(P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01)。(5)BMP-2可促進(jìn)VSMCs表達(dá)RUNX2和Msx-2(P＜0.01，P＜0.01)，而noggin可減少兩者的表達(dá)(P＜0.05，P＜0.05)。(6) TUNEL檢測(cè)結(jié)果表明，

12、鈣化組的凋亡細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P＜0.001);與鈣化組相比，MMPs抑制劑組的凋亡細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.001)。鈣化組的caspase-3活性及cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)均顯著關(guān)于對(duì)照組(P＜0.001，P＜0.001)。與對(duì)照組相比，鈣化組的Bax表達(dá)顯著升高、Bcl-2表達(dá)顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功培養(yǎng)了大鼠VSMC并誘導(dǎo)鈣化。(2)抑制MMPs可減