重組釀酒酵母中CIT2基因的敲除及對(duì)其木糖代謝的影響.pdf

1、能源短缺是目前全世界共同面臨的重大問(wèn)題之一。在我國(guó)能源狀況日益緊迫的背景下，生物乙醇燃料的推廣與使用顯得尤為重要，對(duì)我國(guó)能源結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整已成為能源發(fā)展面臨的重要任務(wù)之一。用于生產(chǎn)生物乙醇燃料的原料主要是淀粉類(lèi)、糖類(lèi)或纖維類(lèi)，秸稈類(lèi)纖維素物質(zhì)具有木質(zhì)纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)，其中半纖維素構(gòu)成了秸稈類(lèi)纖維素物質(zhì)中的相當(dāng)部分約為30％，其水解產(chǎn)物是D-木糖類(lèi)的五碳糖。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以利用淀粉質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

2、，卻不能直接以纖維素為底物進(jìn)行發(fā)酵，原因是纖維素的水解需要三種相互配合分解纖維素的酶，如在有氧條件下可進(jìn)行有氧呼吸，在厭氧條件下可進(jìn)行產(chǎn)乙醇的無(wú)氧呼吸，并且已測(cè)定其全基因組序列，有對(duì)其成熟的基因操作認(rèn)識(shí)，因此被作為工業(yè)上用于發(fā)酵乙醇的常用微生物。但是釀酒酵母卻不能直接代謝利用木糖，因其沒(méi)有專(zhuān)一性代謝木糖生成木酮糖的酶系并且存在細(xì)胞膜上木糖跨膜運(yùn)輸障礙，只有在釀酒酵母中引入木糖代謝流并利用木酮糖的代謝酶系，將其代謝分解隨后進(jìn)入磷酸戊糖途徑

3、，從而進(jìn)入其本身的代謝流，解決了在釀酒酵母中葡萄糖與木糖共發(fā)酵過(guò)程中木糖轉(zhuǎn)、代謝問(wèn)題。
　　 本實(shí)驗(yàn)室對(duì)已構(gòu)建好具有木糖利用功能的釀酒酵母C5D-P-M，研究發(fā)現(xiàn)在重組可利用木糖的釀酒酵母中DUP240家族中的檸檬酸鹽類(lèi)合成酶基因CIT2對(duì)木糖利用具有某種程度的影響。利用基因芯片與基因敲除技術(shù)對(duì)已構(gòu)建好的釀酒酵母進(jìn)行分析與敲除CIT2基因獲得突變株C5D-P-M-CIT2Δ釀酒酵母。并比較實(shí)驗(yàn)菌株與對(duì)照菌株在生理生化與熒光定量結(jié)

4、果中的差異。
　　 通過(guò)綜合比較C5D-P-M-CIT2Δ與對(duì)照菌在生理生化與熒光定量分析結(jié)果中的差異，最終實(shí)驗(yàn)菌株C5D-P-M-CIT2Δ生長(zhǎng)速率平均增速是對(duì)照菌株的1.272倍，每12h多增加CO2的產(chǎn)量是0.0798g，表明CIT2基因?qū)︶劸平湍咐媚咎蔷哂胸?fù)調(diào)控作用。平均乙醇產(chǎn)量是對(duì)照菌的1.098倍。通過(guò)葡萄糖與木糖剩余量的測(cè)定結(jié)果，對(duì)葡萄糖的利用效率要略高0.2g/ml，對(duì)木糖的利用能力要略強(qiáng)，前8個(gè)小時(shí)木糖的利用

5、率是對(duì)照菌的2.222倍，8小時(shí)以后是1倍，表明釀酒酵母中CIT2基因敲除后主要影響的是糖運(yùn)輸過(guò)程，并且此基因?qū)μ沁\(yùn)輸過(guò)程是抑制與阻礙作用。由于糖代謝過(guò)程是受糖運(yùn)輸過(guò)程影響，當(dāng)有豐富糖源供給時(shí)會(huì)增強(qiáng)糖代謝流向下游進(jìn)行，但當(dāng)糖代謝過(guò)程達(dá)到一定程度后糖運(yùn)輸對(duì)糖代謝的推動(dòng)作用就會(huì)不明顯。通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)木糖代謝利用中的相關(guān)基因進(jìn)行分析，最終得知實(shí)驗(yàn)菌株C5D-P-M-CIT2Δ在木糖代謝流中的相關(guān)基因XYL1、XYL2、GND1、TK