Calpain2在梗阻性黃疸大鼠模型肝組織中的表達(dá)及清熱利濕中藥的干預(yù)作用研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過(guò)建立梗阻性黃疸SD大鼠肝損害模型，觀察梗阻性黃疸時(shí)calpain2在大鼠肝組織中的表達(dá)變化;探討梗阻性黃疸術(shù)后中藥茵陳蒿湯對(duì)肝臟的保護(hù)作用及與calpain2表達(dá)的關(guān)系，為臨床圍手術(shù)期合理應(yīng)用中藥提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　選擇成年SD大鼠160只體重(250-270)g，雄性，動(dòng)物級(jí)別為清潔級(jí)，隨機(jī)將大鼠分組:(1)假手術(shù)對(duì)照組（S組）40只;(2)梗阻性黃疸組（O組）40只;(3)梗阻性黃

2、疸模型+中藥組（OC組）40只;(4)梗阻性黃疸模型+生理鹽水組（OW組）40只。四組分別于術(shù)后1、3、5、7D，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)處死大鼠10只，留取血清及肝組織。檢測(cè)血清中TBIL、ALT、AST等生化指標(biāo)含量;另取肝組織固定于5％中性福爾馬林溶液，石蠟包埋，5μm切片行HE染色觀察肝組織的病理改變，并免疫組化檢測(cè)肝組織calpain2的表達(dá);剩余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱，用western blot測(cè)肝組織中calpain2蛋白表

3、達(dá)變化;用Real-Time PCR檢測(cè)大鼠肝組織m-calpain基因表達(dá)量情況。
　　結(jié)果:
　　1.血清生化指標(biāo)的變化:S組術(shù)后第1天ALT、AST輕度升高，后逐漸降低到正常值范圍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與S組比較，O組術(shù)后ALT、AST迅速增高，ALT迅速增高，并維持較高水平，之后逐漸下降(P＜0.05)。OC組與OW組ALT、AST均升高，且均在術(shù)后第一天達(dá)到最大值，之后逐漸降低。OC組在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)ALT、AST的值均

4、低于OW組。S組術(shù)后TBIL無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與S組比較，O組梗阻后TBIL迅速增高，并于第3天達(dá)到峰值(P＜0.05)，后緩慢下降。兩組TBIL均升高明顯，TBIL值術(shù)后迅速升高，并于第三天達(dá)到峰值，之后緩慢下降;OC組在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)TBIL值均低于OW組。
　　2.肝組織病理學(xué)改變:S組肝細(xì)胞無(wú)腫脹、壞死，肝細(xì)胞索排列整齊。O組大鼠肝組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)小膽管和無(wú)管腔的小膽管增生，纖維組織細(xì)胞增生，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性

5、壞死。OW組術(shù)后1天見(jiàn)少量嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);術(shù)后第3天肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂更加明顯，甚至不能分辨小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞形態(tài)大小不一，廣泛變性，術(shù)后第5天，細(xì)胞形態(tài)大小不一，小葉內(nèi)有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，門管區(qū)中度炎癥，部分標(biāo)本可見(jiàn)局灶性竇周纖維組織沉積形成纖維間隔。術(shù)后第7天肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死發(fā)生率增加及程度加重，重者見(jiàn)片狀出血和壞死。OC組術(shù)后病理改變與OW組基本一致，但病理改變程度上較OW組輕。
　　3.采用western blot

6、測(cè)肝組織中calpain2蛋白表達(dá)變化:在蛋白水平上，以GAPDH為內(nèi)參，以S組為對(duì)照組，O組calpain2蛋白的含量與之比較，各時(shí)相點(diǎn)均出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05)，O組calpain2蛋白表達(dá)水平高于S組。以O(shè)W組為對(duì)照組，OC組calpain2蛋白的含量與之比較，各時(shí)相點(diǎn)均出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05)，OC組calpain2蛋白表達(dá)水平低于OW組。O組、OW組、OC組隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，calpain2蛋白表達(dá)均呈上升趨勢(shì)。

7、>　　4.免疫組化檢測(cè)肝組織calpain2的表達(dá):光鏡下，正常組大鼠肝臟內(nèi)表達(dá)較少的calpain2蛋白。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，O組、OW組、OC組calpain2蛋白陽(yáng)性表達(dá)量逐漸增加，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，偶見(jiàn)在細(xì)胞核表達(dá)。與對(duì)照組比較P＜0.05。
　　5、Real-Time PCR檢測(cè)大鼠肝組織m-calpain基因表達(dá)量情況:S組m-calpain基因表達(dá)水平隨造模時(shí)間加長(zhǎng)無(wú)明顯變化。O組m-calpain基因表達(dá)水平

8、隨造模時(shí)間加長(zhǎng)升高，O組與S組比較:O組m-calpain基因表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均高于S組(P＜0.05)。OW組、OC組m-calpain基因表達(dá)水平隨造模時(shí)間加長(zhǎng)升高，OC組與OW組比較:OC組m-calpain基因表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均低于OW組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.OJ時(shí)，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，calpain2蛋白及m-calpain基因表達(dá)水平呈逐漸增加趨勢(shì)，表明在OJ大鼠模型中，存在ERS，且凋