耐輻射菌PprI蛋白的制備及其對小鼠急性輻射損傷作用的研究.pdf

1、目的：耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans)(簡稱DR)是一種對電離輻射,紫外線,強氧化劑和化學誘變劑具有超強耐受力的極端微生物,是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的抗輻射能力最強的生物之一。最近研究表明,負責這一抗性的開關基因-pprI基因在DNA損傷修復中起著極為重要的作用。pprI基因可作為一個保護開關基因誘導DNA修復基因如recA和pprA的表達,在提高細胞抗氧化能力方面,也可能通過調控過氧化氫酶的表達活性來提高抗H2

2、O2的能力。我們近年的研究表明,pprI基因轉染對哺乳動物中子和y射線急性放射損傷具有顯著的防治作用。然而,基因轉染用于放射損傷的防治存在一定的困難和局限性。因此,本課題進一步研究pprI基因原核表達系統(tǒng)的構建、PprI蛋白的表達及其純化,并將其注入受照小鼠體內,研究PprI蛋白對小鼠γ射線急性放射損傷的防治作用。耐輻射球菌pprI基因表達的PprI原核蛋白對真核生物的抗放作用,迄今尚未見國內外文獻報道。
　　 方法：以我們已獲

3、得國家發(fā)明專利的pCMV-HA-pprI質粒為模板,構建重組原核表達質粒pET-28a-His-pprI,并轉化入E.coli BL21(DE3)RP。IPTG誘導融合蛋白表達,SDS-PAGE和Western blot鑒定表達產(chǎn)物。然后采用His-Bind樹脂和分子篩兩步法進行蛋白純化,獲得純化的耐輻射球菌PprI融合蛋白。將PprI融合蛋白注射入ICR小鼠體內,并對PprI蛋白注射組與生理鹽水注射組分別用γ射線進行照射,觀察急性放射

4、損傷小鼠的血細胞數(shù)目和淋巴細胞百分比,應用流式細胞儀檢測骨髓細胞、胸腺及脾臟淋巴細胞的凋亡率,采用CCK8檢測骨髓細胞、胸腺及脾臟淋巴細胞的增殖率,以期探討PprI蛋白對γ射線輻射損傷小鼠的抗放作用。
　　 結果：成功構建了pET-28a-His-pprI原核表達載體,SDS-PAGE和Western blot證實表達產(chǎn)物確為6×His-PprI融合蛋白,相對分子質量約為37KD。純化后獲得了耐輻射球菌PprI融合蛋白。PprI

5、蛋白于小鼠γ射線照射前1天、照射當天和照射后3天以100μg／kg的劑量肌肉注射入小鼠體內。在小鼠照后28天的觀察期間內,由外周血象觀察可見,PprI蛋白注射組小鼠外周血血小板總數(shù)在照后第7天為482.75×109／L,顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P＜0.05)；外周血淋巴細胞百分比在照后第1天為41.00％,第7天為47.25％,均顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)；由細胞凋亡檢測可見,PprI蛋白注射組脾細胞凋亡率在第1天為

6、13.43％,第14天為24.85％,均顯著低于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05):胸腺細胞凋亡率在第14天為8.86％,第28天為6.21％,均顯著低于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05):骨髓細胞凋亡率在第1天為10.70％,第14天為18.74％,第28天為5.31％,均顯著低于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)；由細胞增殖檢測可見,PprI蛋白注射組脾細胞A450值在第14天為0.647,第28天為1.827,均顯著高于生理鹽水注

7、射組小鼠(P<0.05)；胸腺細胞A450值在第7天為0.340,顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)；骨髓細胞A450值在第14天為0.539,顯著高于生理鹽水注射組小鼠(P<0.05)。
　　 結論：⑴成功構建了耐輻射菌pprI基因的原核表達質粒pET-28a-His-pprI,并在E.coli中有效表達aprI融合蛋白,經(jīng)純化定量獲得較大量蛋白質。⑵探索出較合適的PprI蛋白劑量及給藥方法:100μg／kg,肌肉注射