耐輻射球菌pprI基因在酵母菌中的表達及其蛋白抗放作用與機理的研究.pdf

1、目的:
　　Ppr1基因(NCBI:DR-0167)是存在于耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans, DR)R1中的大小約970bp的基因,是耐輻射球菌所特有的負責輻射抗性的一個開關基因。它可以顯著調(diào)節(jié)輻射修復基因recA和pprA等基因的表達,并能增強細胞清除自由基的能力。ppr1基因介導的DNA修復和保護作用,是耐輻射球菌在強輻射作用下仍能保持生存和基因組完整性的重要原因之一。ppr1基因轉(zhuǎn)化模式生物大腸桿

2、菌后,不僅可以增強大腸桿菌的輻射抗性,還能提高大腸桿菌的抗逆性及耐鹽能力。
　　Ppr1基因的抗放作用是通過其功能蛋白實現(xiàn)的。由于pprI是在原核生物耐輻射球菌中所獨有的基因,欲研究其蛋白在真核生物中,特別是對哺乳動物及細胞的作用,須獲得真核表達系統(tǒng)翻譯轉(zhuǎn)錄的具有生物活性的蛋白質(zhì)。將pprI原核基因轉(zhuǎn)入真核生物中穩(wěn)定高效表達,獲得具有生物活性的PprI蛋白,迄今為止在國內(nèi)外尚未見有關報道。真核表達的PprI蛋白提純后應用于動物實驗

3、,在國內(nèi)外也是空白。本課題旨在將ppr1基因轉(zhuǎn)化酵母菌,將目的蛋白提純并應用于受照實驗動物,研究PprI蛋白對酵母菌及哺乳動物小鼠的抗放作用于機理。為進一步用于臨床輻射損傷防治提供有價值的理論和實驗資料。
　　材料與方法:
　　本課題構(gòu)建了pprI基因的畢赤酵母表達載體pHBM-PprI,并成功轉(zhuǎn)化進入GS115酵母菌株。應用質(zhì)譜分析PprI蛋白在酵母菌中的分泌表達。對轉(zhuǎn)化菌株及未轉(zhuǎn)化菌株進行輻射抗性試驗,檢測酵母菌中抗氧化

4、酶SOD、CAT活性,應用Western檢測酵母菌中輻射修復蛋白Rad24和Rad51的表達量,并進行半定量分析。
　　為了研究PprI蛋白對哺乳動物及細胞的抗放作用,本課題構(gòu)建了含有(His)6以及TAT標簽的酵母表達載體pPICZαA-PprI質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化酵母菌株獲得分泌型表達,通過鎳柱層析提純目的蛋白。
　　提純后的PprI蛋白應用于動物實驗。首先觀察了肌肉和腹腔注射對受照小鼠輻射后死亡率的影響。該實驗不僅觀察了兩種注射

5、方式,還分組觀察了注射時間與輻射時間前后及時間的差異。其次,觀察了受照小鼠外周血細胞數(shù)量及骨髓細胞增殖能力的變化。接著分別檢測了受照小鼠器官、組織中SOD、CAT活性變化,以及Rad17和Rad51的表達。最后,應用人體外周血體外培養(yǎng),觀察PprI蛋白對受照淋巴細胞染色體畸變率的影響。
　　結(jié)果:
　　1.本課題根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性,重新合成pprI基因,構(gòu)建了畢赤pHBM-pprI質(zhì)粒表達載體,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

6、菌株。表達產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜分析,證實耐輻射球菌的PprI蛋白在畢赤酵母GS115菌株成功獲得分泌型表達。
　　2.DR菌pprI基因在酵母菌中異位表達,提高了酵母菌的輻射抗性,與對照組比較,pprI基因轉(zhuǎn)染在酵母菌克隆形成率顯著提高(P<0.05); Rad24和Rad51表達量與SOD、CAT活性增高(P<0.05)。
　　3.以本室保存的pCMV-HA-pprI為模板構(gòu)建的pPICZαA–pprI真核表達載體,轉(zhuǎn)化畢赤酵母X3

7、3菌株,經(jīng)SDS-PAGE和His-tag的抗體做Western blotting鑒定,顯示PprI融合蛋白在酵母菌株中成功分泌表達。轉(zhuǎn)化后的菌株發(fā)酵上清液,經(jīng)鎳柱層析提純,獲得了濃度為0.34mg/ml的目的蛋白。
　　4.在輻射前后1h內(nèi),給予小鼠肌肉注射和腹腔注射PprI蛋白可以使小鼠死亡率從對照組的50％降低到20％。PprI蛋白腹腔注射,受照小鼠外周血紅細胞、血小板數(shù)量增加,淋巴細胞百分比增加,小鼠骨髓細胞克隆形成率較對

8、照組明顯著提高(P<0.05)。
　　5.PprI蛋白輔助培養(yǎng)對人離體外周血淋巴細胞染色體畸變無顯著影響。
　　結(jié)論:
　　1.本課題組成功的地合成了新的耐輻射球菌pprI基因編碼序列,首次構(gòu)建了pPICZαA–pprI真核表達載體,在酵母菌中獲得異位高效表達和純化
　　2.轉(zhuǎn)pprI基因酵母菌的輻射抗性顯著增加。轉(zhuǎn)基因酵母菌抗氧化能力及輻射修復蛋白表達增加可能是其輻射抗性增加的分子機理之一。
　　3.在小

9、鼠受照前后注射PprI蛋白,可提高受照小鼠的抗輻射能力,主要表現(xiàn)為小鼠死亡率明顯降低;骨髓細胞克隆形成率提高;小鼠外周血紅細胞、血小板計數(shù)和血淋巴細胞百分率增加。
　　4.PprI蛋白抗放作用機理的研究發(fā)現(xiàn),PprI蛋白可提高受照小鼠紅細胞、血漿、骨髓細胞、肝臟中的CAT、SOD活性,但對心肌細胞、腎臟組織中的CAT、SOD活性無明顯影響;并且增加受照小鼠肝臟、腎臟、脾臟、心臟組織中Rad17、Rad51蛋白的表達量,使其表達時間