質(zhì)膜鈣泵在大鼠耳蝸分布的研究.pdf

1、第一部分：目的：研究質(zhì)膜鈣ATP 酶異構(gòu)體2（Plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2，PMCA2）及其A 端和C 端剪接變異體在新生大鼠耳蝸的表達(dá)。
　　 方法：（1）取出生3-4天（P3-P4）的大鼠，斷頭后分離出耳蝸，固定包埋后做冰凍切片。同時(shí)，分離出耳蝸基底膜做鋪片。通過免疫熒光方法檢測(cè)PMCA2在耳蝸切片以及基底膜的表達(dá)。（2）依次從P3-P4 大鼠分離基底膜（BM，包含Corti’s

2、 器，下同）、螺旋神經(jīng)節(jié)（SG）、螺旋韌帶（SL，包含血管紋，下同）以及完整的耳蝸組織，Trizol 法提取RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,分別通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)PMCA2的A 端和C 端剪接變異體在上述耳蝸組織中的表達(dá)。（3）取同樣年紀(jì)的大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)組織，體外培養(yǎng)后用神經(jīng)元標(biāo)志物抗神經(jīng)微絲蛋白200 抗體（NF-200）鑒定。通過免疫熒光法檢測(cè)PMCA2在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（SGCs）的表達(dá)情況；收集體外培養(yǎng)的SGC

3、s，Trizol 法提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,分別通過RT-PCR法檢測(cè)PMCA2 A 端和C 端的剪接變異體的表達(dá)。（4）分別分離BM、SG、SL以及完整耳蝸組織，提取總蛋白后制備電泳凝膠，跑10％ SDS-PAGE，之后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，用5％脫脂奶粉在室溫下封閉1h后加入兔抗PMCA2 抗體（1:1000），4℃條件下孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:2500），室溫下孵育1h，用增強(qiáng)化

4、學(xué)發(fā)光法顯色。
　　 結(jié)果：（1） PMCA2在外毛細(xì)胞（OHCs）纖毛、SG、血管紋（SV）均有強(qiáng)烈表達(dá)；在Reissner’s membrane （RM）表達(dá)較弱，偶爾在內(nèi)毛細(xì)胞（IHCs）纖毛有表達(dá)。（2）毛細(xì)胞纖毛所表達(dá)的PMCA2 剪接變異體是w/a，SG的是z/b和 z/c，SV是w/a和w/c。另外在整個(gè)耳蝸組織中，檢測(cè)到PMCA2的A 端剪接變異體為w、y和 z，C端的為a、b和c。（3）體外培養(yǎng)的SGCs 胞體

5、透亮，活性良好，NF-200 免疫陽(yáng)性。SGCs的胞膜、胞質(zhì)和軸突均發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光，表明PMCA2 免疫陽(yáng)性。RT-PCR結(jié)果表明SGCs 所表達(dá)的A 端剪接變異體為PMCA2z,而C 端的剪接變異體為PMCA2b和PMCA2c。（4）通過Western blot 方法，用PMCA2 抗體可以檢測(cè)到耳蝸組織中PMCA2的C 端剪接方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BM和SV表達(dá)剪接體PMCA2a，SG表達(dá)PMCA2b，而整個(gè)耳蝸組織表達(dá)PMCA2a和P

6、MCA2b，這與PCR結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：PMCA2在新生大鼠耳蝸組織有不同水平的表達(dá)，其A 端和C 端的剪接變異體也存在差異性表達(dá)。
　　 第二部分：目的：研究質(zhì)膜鈣泵亞型1-3（PMCA1-3）和5F10在發(fā)育大鼠耳蝸毛細(xì)胞的分布。
　　 方法：（1）麻醉后取出生0-21天的大鼠耳蝸，固定后分離出基底膜做鋪片，通過免疫熒光方法檢測(cè)PMCA 亞型的分布情況。依次用0.5％ Triton X-100 破膜、1

7、0％ 正常山羊血清封閉后加入兔抗PMCA1-3或5F10（一種能識(shí)別所有PMCA 亞型的抗體）（1:1000），4℃條件下孵育過夜，PBS 漂洗后加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗兔二抗（1：400），在室溫下孵育2h，PBS 洗滌后加入Alexa Fluor 568 標(biāo)記的鬼比環(huán)肽phalloidin（1:200），在室溫下孵育1h，PBS 漂洗后封片。將共聚焦顯微鏡所有設(shè)置調(diào)節(jié)到同樣的位置，觀察基底膜染色情況。使用Pho

8、toshop或Image J 軟件測(cè)量毛細(xì)胞的免疫熒光強(qiáng)度，繪年齡相關(guān)性表達(dá)曲線。（2）通過免疫金標(biāo)法檢測(cè)PMCA2和5F10在成年大鼠耳蝸毛細(xì)胞的表達(dá)。依次固定、破膜、封閉后加入用含1％ 胎牛血清（BSA）和0.02％ Tween 20的0.05M TBS 溶液（BSA-T20-TBS）稀釋的一抗PMCA2或5F10（1:50），漂洗后加入用BSA-T20-TBS 稀釋的結(jié)合有15nm 金標(biāo)顆粒的羊抗兔IgG 二抗（1：20），在室溫

9、下孵育2h，洗滌后用水樣乙酸雙氧鈾染色20min，在透射電子顯微鏡下觀察標(biāo)記情況。
　　 結(jié)果：（1）在整個(gè)發(fā)育過程中，PMCA1在OHCs和IHCs 纖毛均沒有表達(dá)。在出生后的6天內(nèi)，PMCA1在OHCs和IHCs的胞體均有表達(dá)，之后在OHCs 胞體的表達(dá)水平逐漸下降，到成年期幾乎全部消失。而在IHCs 胞體，PMCA1的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，進(jìn)入成年期才保持穩(wěn)定水平。（2）剛出生的第一周，PMCA2在OHCs 纖毛的表達(dá)快速增強(qiáng)，首

10、先出現(xiàn)在底回OHCs 纖毛，然后是中回，最后是頂回，底回的表達(dá)強(qiáng)于頂回。到了P8，PMCA2在OHCs 纖毛的表達(dá)基本達(dá)到成年水平，頂回、中回和底回之間沒有明顯的區(qū)別。在出生后10天內(nèi)，PMCA2在IHCs 纖毛有微弱的表達(dá)，但到P13后基本消失。在整個(gè)發(fā)育階段，PMCA2在OHCs和IHCs的胞體均沒有表達(dá)。（3）在整個(gè)發(fā)育過程，PMCA3在OHCs和IHCs 纖毛沒有表達(dá)，但在出生6天內(nèi)在OHCs和IHCs胞體均有表達(dá)。到P13以后

11、，PMCA3在OHCs 胞體的表達(dá)基本消失，在IHCs 胞體的表達(dá)雖然稍有下降，但仍處于較高水平，并維持到成年期。（4）5F10在OHCs和IHCs纖毛的表達(dá)模式和PMCA2的相似。5F10在OHCs和IHCs 胞體的表達(dá)在出生后6天逐漸增強(qiáng)，之后逐漸下降，在OHCs 胞體的表達(dá)到成年期幾乎消失，在IHCs 胞體的表達(dá)卻相反，仍維持在一定的水平進(jìn)入成年。（5）免疫金標(biāo)結(jié)果顯示，PMCA2在成年大鼠耳蝸OHCs的3 排靜纖毛上分布的金標(biāo)顆

12、粒數(shù)量相差不明顯。PMCA2和5F10在OHCs 纖毛上分布的金標(biāo)顆粒數(shù)量分別是IHCs 纖毛的3.8 倍和2 倍。PMCA2在頂回OHCs 纖毛分布的金標(biāo)顆粒數(shù)量與底回的沒明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論：PMCA2在OHCs 纖毛開始表達(dá)的時(shí)間（P0-P6）和機(jī)械電轉(zhuǎn)導(dǎo)電流出現(xiàn)時(shí)間是一致的。PMCA2在IHCs 纖毛的表達(dá)弱于OHCs纖毛，表明IHCs的Ca2+負(fù)荷比OHCs小。PMCA2在成年大鼠頂回和底回OHCs 纖毛的表達(dá)沒有明

13、顯差異。PMCA1和PMCA3 主要分布于IHCs 胞體。5F10在P2-P6 大鼠的IHCs 胞體的表達(dá)變化符合IHCs胞體的Ca2+電流變化。由于毛細(xì)胞主要依靠PMCA 來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，因此這種差異性表達(dá)可能是由于PMCA的不同亞型在毛細(xì)胞發(fā)揮著特殊的功能。
　　 第三部分：目的：通過Western blot 方法比較質(zhì)膜鈣泵亞型1-3（PMCA1-3）在P2和P8 大鼠耳蝸基底膜的表達(dá)差異，并檢測(cè)PMCA2在P8

14、 大鼠耳蝸毛細(xì)胞的表達(dá)量。
　　 方法：（1）分別取出生2天和8天的健康SD 大鼠各4只，麻醉后分離出BM，剔除RM和TM，提取總蛋白后測(cè)量蛋白濃度，分別上樣3μg和5μg 總蛋白，跑7.5％SDS-PAGE，之后電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用5％脫脂奶粉室溫封閉2h后加入PMCA2抗體（1:1000），4℃條件下孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:2000），室溫孵育1h，洗滌后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。（2）分別取P2和

15、P8 大鼠基底膜，提取總蛋白后，分別上樣20μg 總蛋白跑7.5％ SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后分別加兔抗PMCA1-3抗體（1:1000），其余步驟同（1）。（3）分別上樣P8 大鼠基底膜總蛋白5μg、10μg和20μg，以及100ng、400ng和800ng BSA 蛋白作為對(duì)照組，跑7.5％ SDS-PAGE。跑完電泳后將膠分為2 部分，部分泳道（含10μg和20μg 總蛋白以及100 ng、400 ng和800ng BAS 蛋白）用

16、于SYPRO 染膠。另一部分泳道（含5μg 總蛋白）用來做Westernblot，檢測(cè)PMCA2的表達(dá)，具體步驟同（1）。通過對(duì)比SYPRO 染膠后的條帶和Westernblot 實(shí)驗(yàn)后底片上的條帶，確定PMCA2 條帶位置，用Photoshop或Image J 軟件測(cè)量其灰度值，通過計(jì)算得出該條帶的PMCA2 含量。
　　 結(jié)果：（1）PMCA2在P2和P8 大鼠BM 均有表達(dá)，在P8的含量高于在P2的。（2）PMCA1在P2

17、和P8 大鼠BM 有微弱的表達(dá)，兩者之間沒有明顯差別；PMCA2在P2和P8 大鼠BM的含量非常豐富；PMCA3在P2和P8 大鼠的BM 幾乎沒有表達(dá)。（3）PMCA2在單個(gè)P8 大鼠BM的含量約為2.5ng。
　　 結(jié)論：PMCA1-3在P2和P8的BM 有著不同的表達(dá)水平。PMCA1表達(dá)較弱，PMCA2有著強(qiáng)烈的表達(dá)，并與年齡的增長(zhǎng)呈正相關(guān)，PMCA3 無(wú)明顯表達(dá)。PMCA1-3在新生大鼠基底膜不同的分布說明了耳蝸毛細(xì)胞對(duì)這