ANP及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)及分布特征.pdf

1、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)(Spiral ganglion, SG)主要是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成的外周感覺神經(jīng)節(jié)組織,位于耳蝸蝸螺旋小管內(nèi),沿耳蝸軸螺旋式分布。螺旋神經(jīng)元(Spiral ganglion neurons, SGNs)是位于螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)的初級聽覺傳入神經(jīng)元,將螺旋器感覺毛細(xì)胞感知的聲信息向聽覺中樞傳遞。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、周圍神經(jīng)支配形式和生理功能特點,可將SGNs分為兩種類型:I型SGNs為胞體較大、有髓鞘的雙極神經(jīng)元,約占SGNs

2、總數(shù)的90~95％,支配內(nèi)毛細(xì)胞并對不同頻率的聲信號進(jìn)行編碼;II型SGNs為胞體較小、無髓鞘的假單極神經(jīng)元,所占比例較少,支配外毛細(xì)胞和部分支持細(xì)胞,通過控制感覺上皮對聲音的敏感性而反饋調(diào)節(jié)聽覺感受。噪聲、耳毒性藥物、老齡化、基因突變等原發(fā)性因素,以及毛細(xì)胞死亡引發(fā)的繼發(fā)性損傷都可造成 SGNs變性、死亡,最終導(dǎo)致永久性聽力損失(感音神經(jīng)性聾)。探明在初級聽覺神經(jīng)元神經(jīng)生理和突觸傳遞過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)以及神經(jīng)活性物

3、質(zhì)的表達(dá)、功能、相互作用,及其在生理、病理條件下參與調(diào)節(jié)聽覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機制,有望為聽力損傷的有效預(yù)防和治療提供重要依據(jù)。
　　雪旺細(xì)胞(Schwann cells, SCs)和衛(wèi)星細(xì)胞(Satellite glial cells, SGCs)是螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)主要的膠質(zhì)細(xì)胞。SCs與SGNs的神經(jīng)纖維(神經(jīng)突)緊密聯(lián)系,并與I型SGNs的神經(jīng)纖維形成髓鞘結(jié)構(gòu);SGCs緊密包繞SGNs胞體,共同構(gòu)成一個功能性單元,并與I型SGNs胞

4、體形成髓鞘結(jié)構(gòu)。盡管對螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)SGCs的具體功能仍然不清楚,但研究發(fā)現(xiàn)外周感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)的SGCs表達(dá)多種離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)受體以及神經(jīng)營養(yǎng)因子來調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸傳遞過程中的神經(jīng)活性,并且形成一個與血腦屏障十分類似的選擇性通透屏障來調(diào)節(jié)局部神經(jīng)微環(huán)境和代謝,這些特點與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有諸多相似之處。感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元-SGCs間相互聯(lián)系或相互作用(Neuron–SGCs communication),是調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸傳

5、遞、神經(jīng)代謝平衡和神經(jīng)保護作用的重要基礎(chǔ)。因此,探尋調(diào)節(jié)螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)SGN-SGC間相互聯(lián)系的新靶點和新藥物,有望為聽力損傷的防治提供新的策略。
　　心鈉素(Atrial natriuretic peptide, ANP)是由心房肌細(xì)胞合成、分泌的28個氨基酸多肽類激素,具有強大的排鈉、利尿和血管舒張活性,是利鈉肽家族中的一員,后者還包括B型利鈉肽和C型利鈉肽。ANP與兩種定位于靶細(xì)胞膜上的高親和功能受體相互作用,進(jìn)而發(fā)揮維持血壓

6、、細(xì)胞外液體容積和心血管體液動態(tài)平衡等重要生物學(xué)效應(yīng)。利鈉肽A型受體(Natriuretic peptide receptor-A, NPR-A)具有鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase, GC)催化活性,可催化細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的形成,繼而調(diào)節(jié)三種cGMP結(jié)合蛋白:①依賴于cGMP的蛋白激酶(PKG)、②依賴于cGMP的磷酸二酯酶(cGMP-regulated PDEs)、③環(huán)核苷酸門控離子通道(CNG),

7、發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),包括調(diào)節(jié)血管緊張度、神經(jīng)元興奮性、跨上皮離子轉(zhuǎn)運,以及視覺、嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。利鈉肽C型受體(Natriuretic peptide receptor-C, NPR-C)也稱為清除受體,缺乏鳥苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域,通過受體介導(dǎo)的內(nèi)化和降解作用調(diào)節(jié)局部利鈉肽濃度。研究表明NPR-C可通過百日咳毒素敏感的抑制性鳥嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白(Gi),或磷脂酶C途徑,抑制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的合成,進(jìn)而影響多種組織第二信使系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)

8、導(dǎo),對cGMP的水平不造成影響。
　　除了心血管系統(tǒng),ANP及其功能受體(NPR-A, NPR-C)在其他組織如腎臟、腎上腺、肺、脂肪組織、視網(wǎng)膜等也具有分布。此外,它們在CNS也具有表達(dá),提示ANP可能作為一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)或神經(jīng)肽參與神經(jīng)和膠質(zhì)功能的調(diào)節(jié)。關(guān)于ANP及其受體在鼠類內(nèi)耳感覺以及分泌區(qū)域的分布也有報道,提示ANP可能作為一種局部激素參與內(nèi)耳水電解質(zhì)平衡的調(diào)節(jié)。既往研究證實ANP受體在豚鼠蝸軸組織以及大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)等

9、耳蝸神經(jīng)感覺區(qū)域具有表達(dá),但ANP及其受體在螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)的具體定位和功能仍然不清楚。基于以上思考,本研究中通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以及蛋白印跡(Western blot)方法,檢測ANP及其功能受體(NPR-A, NPR-C)在大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)的細(xì)胞定位和在出生后不同發(fā)育時期大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)的表達(dá)變化,并探討ANP及其受體對于螺旋神經(jīng)節(jié)功能可能具有的調(diào)節(jié)作用。本

10、研究證實了ANP及其受體在出生后不同發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中具有表達(dá),其主要定位于螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元和衛(wèi)星細(xì)胞中;出生后各發(fā)育時期的大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)具有合成、表達(dá)ANP及其受體的能力,ANP及其受體mRNA和蛋白表達(dá)量隨著出生后發(fā)育發(fā)生變化。我們認(rèn)為ANP可能作為內(nèi)耳的一種重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)或神經(jīng)肽,參與耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)、膠質(zhì)功能以及神經(jīng)元-衛(wèi)星細(xì)胞間相互聯(lián)系的調(diào)節(jié),進(jìn)而影響內(nèi)耳聲信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和聽覺系統(tǒng)發(fā)育。
　　第一部分:ANP

11、及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)
　　目的:明確ANP及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞定位、合成表達(dá)情況。
　　方法:取出生后(第7日,P7)大鼠耳蝸行冰凍切片和超薄切片,通過對耳蝸組織切片行免疫組織化學(xué)染色,激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡檢測ANP及其受體在螺旋神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞定位;取大鼠蝸軸組織,通過RT-PCR和Western blot方法,檢測組織內(nèi)ANP及其受體mRNA和蛋白的合成、表達(dá)情況。
　　結(jié)果:免

12、疫組織化學(xué)方法(免疫熒光和免疫電鏡)證實ANP及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的兩型SGNs以及SGCs具有共表達(dá),其在SGNs的共表達(dá)具有不均一性(在部分SGNs的共表達(dá)相對較弱)。ANP主要定位在I、II型SGNs核周體胞質(zhì)中,以及SGCs胞質(zhì)中;NPR-A和NPR-C主要定位于I、II型SGNs以及SGCs質(zhì)膜上和近質(zhì)膜胞質(zhì)中。以ANP、NPR-A和NPR-C的特異性上、下游引物,通過RT-PCR方法在大鼠蝸軸組織中擴增出其目的基因條

13、帶,證實大鼠蝸軸組織表達(dá)ANP及其受體的mRNA;以ANP、NPR-A和NPR-C的特異性抗體,通過Western blot方法在大鼠蝸軸組織中檢測出其目的蛋白條帶,證實大鼠蝸軸組織表達(dá)ANP及其受體的蛋白。
　　結(jié)論:ANP及其受體主要定位于大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元和衛(wèi)星細(xì)胞中,其mRNA和蛋白在蝸軸組織也具有表達(dá)。本研究證實了大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)具有合成、表達(dá)ANP及其受體的能力,提示ANP可能通過與其受體作用,參與耳蝸螺旋神

14、經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)與膠質(zhì)功能,以及SGN-SGC間相互聯(lián)系的調(diào)節(jié)。
　　第二部分:ANP及其受體在出生后不同發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)
　　目的:明確ANP及其受體在出生后不同發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)特征。
　　方法:取出生后不同發(fā)育時期(P0、P7、P14、P21和P28)大鼠耳蝸行冰凍切
　　片,通過對耳蝸組織切片行免疫組織化學(xué)染色,激光共聚焦顯微鏡檢測ANP及其受體在各發(fā)育時期大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)情況

15、;取各發(fā)育時期大鼠蝸軸組織,通過RT-PCR和Western blot方法檢測組織內(nèi)ANP及其受體mRNA和蛋白的合成、表達(dá)變化。
　　結(jié)果:免疫組織化學(xué)方法證實ANP及其受體在出生后各發(fā)育時期的大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)中均有表達(dá);RT-PCR和 Western blot方法在各發(fā)育時期大鼠蝸軸組織檢測到ANP、NPR-A和NPR-C的mRNA和蛋白,證實其具有合成ANP及其受體的能力。ANP mRNA在大鼠蝸軸組織中的表達(dá)量于出生時(P0

16、)為最低,隨著發(fā)育迅速升高,在成年時期(P28)達(dá)最高水平。NPR-A mRNA在大鼠蝸軸組織中的表達(dá)量于出生時(P0)為最高,隨著發(fā)育迅速降低,在成年時期(P28)達(dá)最低水平。NPR-C mRNA在大鼠蝸軸組織中的表達(dá)量于出生后(P0)為最高,隨著發(fā)育逐漸降低且變化相對較小,在成年時期(P28)有輕微升高。ANP蛋白在大鼠蝸軸組織中的表達(dá)量于出生后(P0)開始升高,于出生后第7日(P7)為最高水平,隨著發(fā)育迅速降低,在成年時期(P28

17、)達(dá)最低水平。NPR-A蛋白在大鼠蝸軸組織中的表達(dá)量于出生時(P0)為最高,隨著發(fā)育逐漸降低,在成年時期(P28)水平相對較低。NPR-C蛋白在大鼠蝸軸組織中的表達(dá)量于出生后(P0)為最高,隨著發(fā)育逐漸降低,至出生后第14日(P14)聽力形成時水平最低,隨后在成年時期(P28)有輕微升高。
　　結(jié)論:ANP及其受體在出生后各發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)中均具有表達(dá),并且其mRNA和蛋白在大鼠蝸軸組織的表達(dá)量隨出生后發(fā)育而發(fā)生改變。A