番茄基因SlGRAS22和SlGRAS27的克隆及功能研究.pdf

1、番茄是茄科內(nèi)的一種重要的植物，類似的茄科植物還有茄子、馬鈴薯、煙草和辣椒。在所有熱帶和溫帶大陸都發(fā)現(xiàn)了茄科植物，這是因?yàn)槠鋸V闊的生長(zhǎng)環(huán)境使其具有生態(tài)和形態(tài)多樣性。大多數(shù)的茄科物種都被認(rèn)定是有市場(chǎng)價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兡軌蛴糜谒幤泛陀卸净衔锏纳a(chǎn)。由于番茄的生長(zhǎng)周期短，轉(zhuǎn)化、嫁接和栽培比較方便，所以在近十幾年中，番茄主要是作為一種有價(jià)值的模式植物被用于實(shí)驗(yàn)室研究。番茄起源于美國(guó)的西南部，從安第斯山脈到歐洲大陸，從熱帶雨林到沙漠地區(qū)，再到高海拔

2、山區(qū)都有分布。根據(jù)一個(gè)比較可信的調(diào)查，番茄是通過(guò)長(zhǎng)期的馴化得來(lái)的一個(gè)農(nóng)產(chǎn)品。番茄首先被西班牙人阿茲臺(tái)克人（墨西哥）發(fā)現(xiàn)，然后是由西班牙的征服者科爾特斯，首先向西班牙引進(jìn)番茄，并再由西班牙將其傳播到了意大利。在經(jīng)過(guò)了16世紀(jì)的馴化之后，番茄在全球范圍內(nèi)廣泛被應(yīng)用。在2014年全球番茄生產(chǎn)量達(dá)到了1.7億噸，所以它是世界范圍內(nèi)最為重要的茄科植物之一，這也表示番茄是最經(jīng)濟(jì)價(jià)值的茄科蔬菜。它也是許多可食用產(chǎn)品如果汁、醬料、醬汁、湯和粉末等的重要

3、組成部分。國(guó)際茄科植物基因組計(jì)劃（SOL）目前開(kāi)始了關(guān)于茄科基因信息網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，以描述其基因和蛋白質(zhì)相互作用對(duì)茄科內(nèi)超過(guò)3000種植物造成的生態(tài)學(xué)和形態(tài)學(xué)范疇的差異。
　　轉(zhuǎn)錄因子作為活細(xì)胞中主要調(diào)控蛋白的基因，通常表現(xiàn)出特異性的 DNA結(jié)合序列和在廣泛基因中具有抑制或觸發(fā)轉(zhuǎn)錄的能力。大約7％的基因都是轉(zhuǎn)錄因子，而且轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是許多生物學(xué)機(jī)制中的關(guān)鍵因素。通常轉(zhuǎn)錄因子是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與 D

4、NA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，它也包含核定位信號(hào)和寡聚位點(diǎn)。然而在對(duì)大量的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或與 DNA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄組功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中，參與不同代謝途徑的基因表達(dá)的變化是具有多樣的。此外，編碼酶的大量基因轉(zhuǎn)錄物參與抗壞血酸的生物合成，表現(xiàn)出的晝夜和光影響的變化，表明也存在影響調(diào)控的外部環(huán)境因素。事實(shí)上，環(huán)境調(diào)控是影響水果營(yíng)養(yǎng)狀況的重點(diǎn)，另外生物合成也可能是在發(fā)育調(diào)控過(guò)程中受到多種轉(zhuǎn)錄因子的控制。通過(guò)研究與生物合成基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄

5、因子可以解釋影響代謝物積累的調(diào)節(jié)機(jī)制。通過(guò)研究已經(jīng)鑒定出的許多與類胡蘿卜素代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，比如在擬南芥中類胡蘿卜素的調(diào)節(jié)已被證明是通過(guò)RAP2和PIF1調(diào)節(jié)PSY轉(zhuǎn)錄完成的。
　　在植物體中，GRAS是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，它主要是作為幾種生長(zhǎng)協(xié)同和環(huán)境調(diào)節(jié)信號(hào)，如腋芽的分生組織形成，植物激素，根的向性，光信號(hào)，生物和非生物脅迫。已經(jīng)有幾項(xiàng)研究證明了轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中的幾種生理機(jī)制和調(diào)節(jié)復(fù)合物中起著重要作用。通常，GRAS

6、家族基因編碼的蛋白質(zhì)具有保守的末端 C，也被稱為 GRAS結(jié)構(gòu)域，其包含了幾個(gè)組織和保守基序，其中包含兩個(gè)富含亮氨酸的區(qū)域（LHR）I和 II，VHIID，PFYRE和 SAW。另一方面，這個(gè)結(jié)構(gòu)域以不同的長(zhǎng)度和順序共享 N個(gè)末端，這表明它主要參與每個(gè)基因特定功能的表達(dá)。大量的 GRAS基因在不同的植物物種中被鑒定出來(lái)，如楊樹(shù)中的106個(gè)，擬南芥中的34個(gè)，水稻中的的60個(gè)，番茄中的53個(gè)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，這些基因被分為13個(gè) GR

7、AS蛋白亞家族。通過(guò)對(duì)整個(gè) GRAS家族基因進(jìn)行研究，只有少數(shù)基因具有特異功能。目前，番茄作為一種重要的肉質(zhì)果實(shí)和模式植物通常被用來(lái)研究GRAS家族基因的主要功能。
　　在本研究中，我們選取SlGRAS家族中的SlGRAS22和SlGRAS27兩個(gè)基因在野生番茄品種（WT）Ailsa Craig(AC++)中研究其基因功能，SlGRAS22屬于Pt20 GRAS蛋白亞家族，而 SlGRAS27是 Os4 GRAS蛋白亞家族成員之一

8、，它們?cè)诜褦?shù)據(jù)庫(kù)里的編號(hào)分別為 solyc01g079370和 solyc02g094340，編碼蛋白分別為844個(gè)氨基酸和680個(gè)氨基酸。通過(guò)比較番茄各基因家族的氨基酸長(zhǎng)度，等電點(diǎn)，分子量和疏水性等來(lái)對(duì)兩個(gè)基因的生物信息學(xué)進(jìn)行比較，然后再通過(guò)與其他番茄基因和其他物種的基因一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后，我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因與 sldella基因功能相似。
　　通過(guò)對(duì)野生型(AC++）番茄里進(jìn)行所有組織基因表達(dá)模式的分析，發(fā)現(xiàn)SlGRAS

9、22基因的主要表達(dá)是在果實(shí)發(fā)育階段的未成熟期（IMG時(shí)期）和破色后4天（B+4時(shí)期）的時(shí)期，之后我們通過(guò)在另一個(gè)番茄品種 Nr（主要用于研究番茄成熟）內(nèi)進(jìn)行表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)在破色后7天的時(shí)期（B+7）和未成熟時(shí)期（IMG）中表達(dá)最高，這說(shuō)明該基因在果實(shí)生長(zhǎng)和成熟中可能具有重要作用。首先我們?cè)谳嗥突ǘ渲袡z測(cè)到了 SlGRAS27基因的表達(dá)，隨后我們進(jìn)行了進(jìn)一步的分析研究，在花的不同部位進(jìn)行基因表達(dá)量分析，我們發(fā)現(xiàn)在花瓣中出現(xiàn)了大量表達(dá)

10、，特別是花瓣和雌蕊，這說(shuō)明該基因與花的維持和生長(zhǎng)有關(guān)。隨后我們進(jìn)行了進(jìn)一步的功能研究，設(shè)計(jì)了SlGRAS22和SlGRAS27基因的沉默引物，并通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，連接到 A尾，然后連接正向和反向，再連接到終載體pHANNIBAL上。這種連接是通過(guò)切割位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶了，再利用大腸桿菌構(gòu)建基因沉默載體。利用 RNA干擾技術(shù)構(gòu)建基因沉默載體后，再利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到野生型番茄的子葉上，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。最后再將轉(zhuǎn)基因番茄植株馴化到田間種