microRNA-34a在胃癌細胞中的作用及其調控機制的研究.pdf

1、背景：
　　胃癌（gastric cancer）是一種具有較高發(fā)病率的惡性腫瘤，預后比較差。近年研究發(fā)現(xiàn)非編碼小RNA（microRNA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著極其重要的作用。microRNA-34a（miR-34a）定位在人類染色體1p36，在人類腫瘤中常發(fā)生缺失，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結腸癌等，但miR-34a與胃癌的關系至今未見報道，因此本研究擬探討miR-34a在胃癌細胞中的表達及其調控機制，同時探討miR-34a

2、與胃癌細胞對化療敏感性之間的關系以及作用機制，為胃癌治療提供新方法和新的干預靶點。
　　方法：
　　在體外分別培養(yǎng)人胃癌細胞系：MGC80-3、HGC-27、NCI-N87、SGC-7901和正常人胃粘膜上皮細胞GES-1，利用實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-34a在胃癌細胞系和正常人胃粘膜上皮細胞GES-1中的表達情況；在胃癌細胞系HGC-27細胞中轉染mi

3、R-34a mimic，采用qRT-PCR方法檢測HGC-27細胞中miR-34a表達變化，以驗證轉染效果；然后通過MTT法檢測miR-34a對胃癌細胞系HGC-27細胞的活力影響；流式細胞儀分析miR-34a對HGC-27細胞增殖的影響；采用Annexin V/PI雙染法分析miR-34a對HGC-27細胞凋亡的影響；采用transwell侵襲小室檢測miR-34a對HGC-27細胞遷移的影響；采用Western blot方法檢測mi

4、R-34a對細胞中survivin蛋白表達的影響。分別體外培養(yǎng)人胃癌細胞系：SGC-7901和順鉑耐藥細胞株(SGC-7901/DDP)，采用qRT-PCR和Western blot檢測miR-34a、survivin在兩種胃癌細胞中的表達情況；在胃癌細胞SGC-7901和SGC-7901/DDP中轉染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后48h，采用qRT-PCR檢測轉染后細胞中miR-34a的表達變化；采用

5、MTT檢測miR-34a的異位表達對順鉑誘導的胃癌細胞細胞活力的影響；采用Annexin V/PI雙染法，流式細胞儀分析miR-34a的異位表達對順鉑誘導的胃癌細胞凋亡的影響；應用PI3K通路抑制劑Wortmannin進行干預，然后采用Western blot方法和流式細胞儀檢測miR-34a異位表達對順鉑誘導的胃癌細胞中AKT和p-AKT表達的影響、以及對凋亡的影響。
　　結果：
　　qRT-PCR檢測結果顯示：與正常胃粘

6、膜上皮細胞GES-1相比，miR-34a在胃癌細胞系中的表達顯著下降(p<0.01)；與對照組相比，在胃癌細胞HGC-27中轉染miR-34a mimic后48h，細胞中miR-34a的表達顯著上升(p<0.01)，提示miR-34a mimic轉染成功；MTT分析結果顯示：在胃癌細胞HGC-27中過表達miR-34a后，細胞活力明顯下降(p<0.05)；流式細胞儀分析結果顯示：過表達miR-34a后，細胞的增殖指數(shù)明顯下降(p<0.0

7、5)；細胞的凋亡顯著增加(p<0.01)；transwell侵襲小室檢測結果顯示：增強miR-34a的表達后，穿過transwell小室的細胞數(shù)顯著降低(p<0.01)；Western blot檢測結果顯示：與對照組相比，在胃癌細胞HGC-27中轉染miR-34a mimic48h后，細胞中survivin蛋白的表達顯著下降(p<0.01)，即miR-34a與survivin蛋白的表達呈負相關。采用qRT-PCR和Western blo

8、t檢測結果顯示：與胃癌細胞SGC-7901相比，miR-34a在順鉑耐藥細胞株(SGC-7901/DDP)中的表達明顯下降(p<0.05)，而survivin的表達卻明顯上調(p<0.05)；與不經過任何處理的SGC-7901細胞相比，在SGC-7901細胞中轉染miR-34a mimic48h后，細胞中miR-34a的表達顯著上升(p<0.01)，轉染miR-34a inhibitor后，miR-34a的表達明顯下降(p<0.05)，

9、提示轉染效率高；MTT和流式細胞儀檢測結果顯示：在順鉑作用下的SGC-7901細胞中抑制miR-34a表達后，細胞活力明顯上升(p<0.05)，細胞凋亡數(shù)明顯減少(p<0.05)；而在順鉑作用下的SGC-7901細胞中過miR-34a表達后，細胞活力明顯下降(p<0.05)，細胞凋亡數(shù)明顯增加(p<0.05)，提示miR-34a與胃癌細胞順鉑化療的敏感性有關，即過表達miR-34a有助于提高胃癌細胞對順鉑化療的敏感性；Western b

10、lot和流式細胞儀檢測結果顯示：與不經過任何處理的SGC-7901細胞相比，Wortmannin可明顯抑制miR-34a inhibitor和DDP誘導的p-AKT表達的升高(p<0.05)；促進細胞凋亡(p<0.05)。
　　結論：
　　miR-34a在人胃癌細胞系中呈現(xiàn)出表達抑制，miR-34a可負性調節(jié)survivin蛋白的表達，并抑制胃癌細胞增殖和侵襲，促進其凋亡，增強miR-34a表達或沉默survivin基因的治