microRNA-200c在胃癌SGC7901-CDDP細胞中的作用及其機制的研究.pdf

1、在我國，胃癌的發(fā)病率很高，由于胃癌篩查沒有得到普及和重視，大多數(shù)胃癌到中晚期才得到診斷，化療仍是主要的治療手段。但是腫瘤原發(fā)或繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生致使腫瘤對化療不敏感，最終導致治療的失敗。多年來對耐藥相關基因功能的研究揭示了眾多的耐藥機制，在指導臨床治療中逐漸顯示出重要的作用，然而由于這些基因之間相互缺乏聯(lián)系，因而所進行的研究也相對獨立。近年來研究顯示一類長度為21～25nt的單鏈非編碼微小RNA(microRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重

2、要的作用。生物信息學顯示microRNA通過調節(jié)不同的基因而發(fā)揮重要的生物學效應，從而使一些看似相互獨立的基因之間建立了緊密的聯(lián)系。在腫瘤耐藥方面，研究顯示相同microRNA能夠通過調控不同的靶點而影響腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。在胃癌化療臨床藥物的選擇中，順鉑(cisplatin，CDDP)仍是基礎化療藥物之一。SGC7901/CDDP是胃癌順鉑耐藥的細胞株。雖然已有一些關于其耐藥機制的報道，但是目前尚未有對該細胞的microRN

3、A表達譜特征的報道，同時microRNA在胃癌順鉑耐藥過程中所起的作用也沒有深入的研究。本研究對SGC7901/CDDP細胞的耐藥特性進行了分析；對SGC7901/CDDP及其親代順鉑敏感的SGC7901細胞進行microRNA表達譜的高通量篩選，通過與SGC7901細胞microRNA的表達譜進行對比，篩選出其中差異表達的microRNA，并應用靶點預測軟件進行靶點預測及生物信息學分析，尋找潛在的microRNA靶點或調控通路，以期改

4、善胃癌細胞的耐藥問題。在建立SGC7901/CDDP細胞microRNA表達譜的基礎上，進一步探討了microRNA-200c對胃癌SGC7901/CDDP細胞耐藥及增殖的影響，并觀察了其對E-cadherin、PTEN/Akt通路及凋亡蛋白Bcl-2和BAX的調控作用。同時通過抑制高表達E-cadherin的SGC7901細胞中E-cadherin的表達，觀察細胞的耐藥性和增殖能力的改變和PTEN/Akt通路及凋亡蛋白Bcl-2和BA

5、X的變化，分析E-cadherin對細胞耐藥和增殖的影響及其機制，探討E-cadherin是否介導了microRNA-200c對PTEN/Akt通路及凋亡蛋白的間接調控。
　　 第一部分胃癌SGC7901/CDDP細胞microRNA表達譜及其生物信息學分析
　　 目的：研究SGC7901/CDDP細胞的耐藥特性，通過對比SGC7901/CDDP耐藥細胞與親代細胞microRNA表達譜的差異，嘗試在microRNA水平尋

6、找到胃癌細胞耐藥的機制和改善耐藥的潛在治療靶點。
　　 方法：采用MTT法檢測SGC7901/CDDP及SGC7901細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的藥物敏感性；采用microRNA芯片檢測兩株細胞的microRNA表達譜并進行比對篩選出差異表達的microRNA;對異常表達的microRNA分別應用TargetScan(http://www.targetscan．org/)及MicroCosm Targets Ver

7、sion5(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)預測microRNA靶點，并進行比對后篩選出兩種方法均能預測到的共同的靶點；同時根據(jù)靶點所對應的microRNA表達改變情況將靶點分為microRNA表達降低組和microRNA表達增高組。對microRNA表達降低組和microRNA表達增高組的靶點進一步采用Blast2GO進行在線批量GO分析(ht

8、tp://www.blast2go.org/start_blast2go)，對靶點的生物學進程進行注釋，預測microRNA參與的生物學功能。
　　 結果：
　　 1 兩株細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的敏感性：不同濃度的順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇作用48h后，SGC7901/CDDP及SGC7901兩株細胞的存活率不同。SGC7901/CDDP細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50分別為：

9、11.245±0.272mg/L、0.763±0.043mg/L、12.154±2.036mg/L和3.277±0.426mg/L;SGC7901細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50分別為：2.206±0.256mg/L、0.229±0.020mg/L、4.481±0.544mg/L和1.528±0.097mg/L。與SGC7901細胞相比，SGC7901/CDDP對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50均顯著高于S

10、GC7901細胞(P＜0.05)，SGC7901/CDDP對四種抗腫瘤藥物的敏感性降低。
　　 2 RNA的質量檢測：從SGC7901/CDDP及SGC7901細胞提取出總RNA的濃度分別為：1145.77mg/L和1853.74mg/L，A260/A280值均在1.9～2.0之間，從甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結果來看。其18S和28S條帶清晰，亮度比約為1：2，總RNA純度達到實驗要求且無明顯降解。
　　 3 microR

11、NA芯片檢測結果：經(jīng)Hy3熒光標記、純化，進行芯片雜交，圖像采集，數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，以兩種細胞Hy3熒光標記信號強度的比值≤0.5或≥2為標準判定差異表達microRNA。結果顯示：與SGC7901細胞相比，SGC7901/CDDP細胞中表達下調超過2倍的microRNA有14個，分別為：microRNA-33a、microRNA-200c、microRNA-302c*、microRNA-488、microRNA-148a、micr

12、oRNA-141、microRNA-212、microRNA-576-3p、microRNA-660、microRNA-338-3p、microRNA-24-1*、microRNA-589、microRNA-887和microRNA-22*;表達上調超過2倍的microRNA有5個，分別為：microRNA-1246、microRNA-943、microRNA-1290、microRNA-516a-5p和microRNA-34b。

13、>　　 4 microRNA預測靶點的生物信息學分析結果：microRNA表達降低組共有451個預測靶點，Blast2GO分析顯示這些靶點參與信號轉導、轉錄調控、蛋白質磷酸化、跨膜轉運、藥物敏感性、細胞周期、分化、凋亡、增殖、粘附、DNA修復等生物學進程。microRNA表達增高組共有98個預測靶點，Blast2GO分析顯示這些靶點參與信號轉導、轉錄調控、跨膜轉運、細胞周期、凋亡、增殖、分化、組織發(fā)生等生物學進程。
　　 結論

14、：
　　 1 與親代胃癌SGC7901細胞比較，胃癌SGC7901/CDDP細胞除了對順鉑耐藥性顯著增高外，其對阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的耐藥性也出現(xiàn)增加，呈現(xiàn)出多藥耐藥的表型。
　　 2 通過利用microRNA芯片篩選出胃癌順鉑耐藥SGC7901/CDDP細胞及其親本SGC7901細胞之間差異表達的microRNAs，其中microRNA-33a、microRNA-200c、microRNA-302c*、micr

15、oRNA-488、microRNA-148a、microRNA-141、microRNA-212等14個microRNAs在SGC7901/CDDP細胞中表達下調、microRNA-1246、microRNA-943、microRNA-1290、microRNA-516a-5p、microRNA-34b在SGC7901/CDDP細胞中表達上調。
　　 3 通過對這些異常改變microRNA的預測靶點進行GO分析，提示這些異常表達

16、的microRNA具有復雜的生物學效應，表明多個microRNA參與了SGC7901/CDDP細胞的多藥耐藥。
　　 第二部分 microRNA-200c對胃癌SGC7901/CDDP細胞耐藥和增殖的影響
　　 目的：microRNA-200c是我們在上一部分實驗中通過microRNA芯片篩選出的SGC7901/CDDP耐藥細胞與親代SGC7901細胞表達差異的microRNA。本部分實驗試圖進一步驗證microRNA芯

17、片篩選的結果，同時通過改變microRNA-200c的表達探索其對SGC7901/CDDP細胞藥物敏感性及增殖所起的作用。
　　 方法：采用實時熒光定量PCR對microRNA芯片篩選出的microRNA-200c的表達水平進行驗證；采用siPORTTM NeoFXTM Transfection Agent將microRNA-200c前體（pre-200c）或陰性對照序列轉染到SGC7901/CDDP細胞中，轉染24h后提取細胞

18、總RNA采用實時熒光定量PCR檢測microRNA-200c表達水平的改變；采用MTT法檢測轉染后的SGC7901/CDDP細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇敏感性的改變；采用細胞計數(shù)法檢測轉染后的SGC7901/CDDP細胞體外增殖能力的改變。
　　 結果：
　　 1 microRNA-200c在兩株細胞中表達的差異：實時熒光定量PCR結果顯示；SGC7901/CDDP細胞microRNA-200c的△Ct為15

19、.470±0.036，SGC7901細胞的△Ct為14.657±0.229。SGC7901/CDDP細胞microRNA-200c的相對表達水平是SGC7901細胞的0.573±0.084倍，顯著低子敏感株細胞的表達(P＜0.05)。
　　 2 SGC7901/CDDP細胞轉染24h后microRNA-200c的表達改變：實時熒光定量PCR結果顯示SGC7901/CDDP細胞轉染pre-200c24h后microRNA-200c

20、的△Ct為12.660±0.079，陰性對照組△Ct為15.493±0.080。細胞轉染pre-200c24h后microRNA-200c相對表達水平是陰性對照組的7.128±0.159倍(P＜0.05)。
　　 3 microRNA-200c對SGC7901/CDDP細胞耐藥性的影響：轉染pre-200c后的SGC7901/CDDP細胞增加了對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的敏感性。IC50分別為：7.518±0.186m

21、g/L、0.381±0.053mg/L、7.267±0.090mg/L及1.705±0.332mg/L;陰性對照組分別為：12.180±0.294mg/L、0.721±0.034mg/L、11.534±0.598mg/L及3.140±0.403mg/L。兩者差異顯著(P＜0.05）。
　　 4 microRNA-200c對SGC7901/CDDP細胞增殖能力的影響：轉染pre-200c的SGC7901/CDDP細胞接種后從第3天

22、開始細胞數(shù)目顯著低于陰性對照組(P＜0.05），增殖能力顯著降低。
　　 結論：
　　 1 通過實時熒光定量PCR證實microRNA-200c在胃癌順鉑耐藥細胞株SGC7901/CDDP中表達下調，驗證了microRNA芯片的結果。
　　 2 上調microRNA-200c的表達能顯著增加SGC7901/CDDP細胞在體外對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇四種抗腫瘤藥物的敏感性，發(fā)揮化療增敏作用。
　　

23、 3 上調microRNA-200c的表達能顯著抑制SGC7901/CDDP細胞的體外增殖能力。
　　 第三部分 microRNA-200c逆轉SGC7901/CDDP細胞耐藥及抑制增殖的分子機制
　　 目的：為了明確microRNA-200c逆轉SGC7901/CDDP細脆耐藥及抑制增殖的分子機制，我們試圖通過分析SGC7901/CDDP耐藥細胞與親代SGC7901細胞一些相關蛋白E-cadherin、PTEN、p-

24、Akt、Akt、Bcl-2和BAX表達的差異，以及microRNA-200c表達增加后這些蛋白表達水平的變化，尋找microRNA-200c調控的相關蛋白及使SGC7901/CDDP細胞發(fā)生耐藥的效應蛋白。
　　 方法：采用Western blot法檢測SGC7901/CDDP及SGC7901細胞中E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表達差異；采用siPORTTM NeoFXTM Trans

25、fection Agent將pre-200c或陰性對照序列轉染到SGC7901/CDDP細胞中，轉染后72h提取細胞總蛋白，采用Western blot法檢測轉染后的SGC7901/CDDP細脆E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表達的改變。
　　 結果：
　　 1 兩株細胞中E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表達：SGC7901/CDDP細胞

26、E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達量分別為：0.098±0.030、0.178±0.064、1.019±0.093、1.181±0.102、0.267±0.018和0.215±0.026;SGC7901細胞E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達量分別為：0.467±0.061、874±0.056、0.166±0.017、1.231±0.163

27、、0.108±0.011和0.366±0.017。與SGC7901細胞相比，SGC7901/CDDP細胞中p-Akt和Bcl-2蛋白的相對表達量顯著增高(P＜0.05），而E-cadherin、PTEN和BAX蛋白的相對表達量顯著降低（P＜0.05），總Akt的相對表達量在兩組之間未見顯著差異(P＞0.05)。
　　 2 microRNA-200c對SGC7901/CDDP細胞E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、

28、Bcl-2和BAX蛋白表達的影響：SGC7901/CDDP細胞轉染pre-200c后E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達量分別為：0.471±0.010、0.589±0.016、0.220±0.035、1.255±0.116、0.074±0.008和0.380±0.008;陰性對照組的E-cadherin、PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達量分別為：0.109±

29、0.002、0.111±0.002、0.687±0.086、1.291±0.117、0.442±0.020和0.111±0.005。轉染pre-200c組細胞的E-cadherin、PTEN、BAX蛋白的相對表達量顯著高于陰性對照組(P＜0.05)，而p-Akt及Bcl-2蛋白的表達顯著低于陰性對照組(P＜0.05），總Akt的相對表達量在兩組之間未見顯著差異(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1 SGC7901/C

30、DDP細胞耐藥表型與E-cadherin、PTEN及BAX蛋白表達的下降、Akt通路激活和Bcl-2蛋白的表達增加有關。
　　 2 microRNA-200c對SGC7901/CDDP細胞耐藥逆轉和增殖抑制的作用與誘導E-cadherin、PTEN及BAX蛋白的表達、抑制Akt通路的激活和下調Bcl-2蛋白的表達有關。
　　 第四部分 E-cadherin siRNA對SGC7901細胞耐藥與增殖的影響及分子機制研究

31、r>　　 目的：前一部分的研究結果提示microRNA-200c參與調控一系列耐藥相關蛋白，為了進一步探討microRNA-200c與這些蛋白以及這些蛋白彼此之間的信號傳導順序，我們根據(jù)其它研究的結果，研究E-cadherin是否介導了從microRNA-200c傳導下來的調控信息，同時探討E-cadherin對SGC7901細胞耐藥和增殖的影響。
　　 方法：采用Lipofectamine2000將E-cadherin si

32、RNA或其陰性對照序列轉染到SGC7901細胞中，轉染后24、48、72h分別提取細胞總蛋白采用Western blot檢測轉染后細胞的E-cadherin蛋白的抑制效率；SGC7901細胞轉染24h后采用MTT法檢測轉染后的SGC7901細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇敏感性的改變，采用細胞計數(shù)法檢測轉染后的SGC7901細胞體外增殖能力的改變；SGC7901細胞轉染72h后提取細胞的總蛋白，采用Western blot檢測轉

33、染后細胞的PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表達的改變。
　　 結果：
　　 1 SGC7901細胞轉染后的E-cadherin蛋白表達改變：SGC7901細胞轉染E-cadherin siRNA24、48和72h后E-cadherin蛋白的相對表達量分別為：0.244±0.006、0.155±0.007和0.118±0.014，陰性對照組為0.527±0.006，轉染E-cadherin siRNA后

34、E-cadherin蛋白的表達受到顯著抑制（P＜0.05）。
　　 2 SGC7901細胞轉染E-cadherin siRNA后對化療藥物敏感性的改變：轉染E-cadherin siRNA后的SGC7901細胞降低了對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶和紫杉醇的敏感性。IC50分別為：4.375±0.199mg/L、0.368±0.042mg/L、6.855±0.780mg/L和2.530±0.259mg/L;陰性對照組分別為：2.88

35、2±0.166mg/L、0.228±0.012mg/L、4.058±0.946mg/L和1.483±0.225mg/L。兩組差異顯著（P＜0.05）。
　　 3 E-cadherin siRNA對SGC7901細胞增殖能力的影響：轉染E-cadherin siRNA的SGC7901細胞接種后從第4天開始細胞數(shù)目顯著高于陰性對照組（P＜0.05），細胞的增殖能力顯著增強。
　　 4 E-cadherin siRNA對SGC

36、7901細胞PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白表達的影響：轉染E-cadherin siRNA72h后SGC7901細胞的PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達量分別為：0.148±0.010、0.455±0.034、1.045±0.182、0.328±0.014和0.139±0.013;轉染陰性對照序列72h后SGC7901細胞的PTEN、p-Akt、Akt、Bcl-2和BAX蛋白的相對表達量

37、分別為：0.531±0.014、0.224±0.049、1.158±0.143、0.114±0.012和0.369±0.016。轉染E-cadherin siRNA72h后SGC7901細胞的p-Akt和Bcl-2蛋白的相對表達量顯著高于陰性對照組，而PTEN和BAX蛋白的相對表達量顯著低于對照組(P＜0.05)，總Akt的相對表達量在兩組之間未見顯著差異(P＞0.05）。
　　 結論：
　　 1 抑制E-cadheri

38、n的表達能顯著降低SGC7901細胞在體外對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇四種抗腫瘤藥物的敏感性，增強了細胞對化療藥物的耐受。
　　 2 抑制E-cadherin的表達能顯著改變SGC7901細胞的體外增殖能力，導致細胞增殖能力增加。
　　 3 抑制E-cadherin表達導致的SGC7901細胞耐藥和增殖與下調PTEN及BAX蛋白的表達、激活Akt信號通路和上調Bcl-2蛋白的表達有關。
　　 4 在胃癌細