MicroRNA-34a對心肌細胞SH2B3表達的調(diào)控作用.pdf

1、心肌纖維化嚴重影響心臟的正常功能，在外界因素刺激下，細胞外基質(zhì)中成分的異常是導致纖維化的最主要因素，而延緩或阻止纖維化的發(fā)生和進展可明顯改善心肌功能。隨著研究的不斷深入，通過調(diào)控細胞活性來影響心肌纖維化已成為治療該類疾病的主要目標。因此，了解心肌纖維化的發(fā)生機制及調(diào)節(jié)途徑顯得非常重要。當心肌細胞接受外界不良刺激后，會通過一系列步驟將信號傳導入心肌細胞內(nèi)部，從而影響細胞的功能和活性。
　　SH2B3屬于SH2B接頭蛋白家族成員之一，

2、影響細胞內(nèi)分子的定位，可影響許多由Janus激酶和受體酪氨酸激酶介導的信號通路活性。研究表明，SH2B3參與造血細胞的分化，并與心肌梗死、代謝綜合征、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡病、類風濕性關節(jié)炎等疾病關系相當密切。在小鼠心肌梗死模型中，敲除了SH2B3表達后，其纖維化程度隨之升高，在當前的研究成果中，已提示在心肌梗死后纖維化過程中SH2B3發(fā)揮了一定的作用，但到目前為止，關于該分子在心肌纖維化過程中的表達調(diào)控機制還不清楚。microR

3、NA(miRNA)是一類含21-25個堿基的非編碼單鏈核苷酸，近年來被認為是一種新的轉錄后調(diào)節(jié)子，可通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)(3' untranslated region，3'UTR)相互作用來調(diào)節(jié)靶基因的表達，最終影響細胞活性。該分子的作用特點是同一miRNA可對多個靶基因進行同時調(diào)控。
　　越來越多的證據(jù)表明，miRNA在心血管疾病，特別是心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用。最新有關研究已表明，在心肌梗死模型中miR-34a參與了

4、心肌細胞收縮功能的調(diào)控，抑制其表達可提高心肌的收縮功能。目前Flister等研究均已發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過靶向調(diào)控Smad4、促進分泌纖維化相關膠原，使其在心肌梗死后纖維化區(qū)域中的表達顯然上調(diào)，并最終影響了心肌纖維化過程。
　　目的：
　　(1)觀察轉化生長因子-β1對miR-34a和SH2B3表達的作用;
　　(2)明確miR-34a對SH2B3的調(diào)控作用。
　　方法：
　　為了證明miR-34a可能調(diào)

5、控SH2B3的表達，本課題首先體外培養(yǎng)心肌細胞，分別在接受轉化生長因子-β1和缺氧處理后，提取總蛋白和RNA后，采用Western blot和qRT-PCR法檢測SH2B3在蛋白水平和mRNA水平的表達量變化;采用qRT-PCR法檢測接受以上刺激后，miR-34a的表達;在心肌細胞中轉染miR-34a mimics和miR-34a inhibitor后，采用Western blot和qRT-PCR法檢測SH2B3在蛋白水平和mRNA水平

6、的表達量變化;構建針對miR-34a作用位點的SH2B3熒光素酶報告基因載體，采用熒光素酶報告基因法檢測miR-34a對SH2B3基因3' UTR區(qū)活性的影響。
　　結果：
　　實驗結果表明，在轉化生長因子-β1誘導心肌細胞作用過程中，SH2B3在mRNA和蛋白水平的表達均降低;miR-34a的表達水平升高;α-SMA蛋白的表達升高。Western blot和qRT-PCR結果顯示轉染miR-34a模擬物后，SH2B3的表達

7、降低;轉染miR-34a抑制物后SH2B3的表達升高。熒光素酶報告檢測發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過影響SH2B33'UTR活性，調(diào)控其表達。另外，在心肌細胞接受缺氧刺激后，SH2B3的表達量隨著刺激時間的延長而降低，miR-34a的表達則升高，這種表達的相反趨勢進一步證明兩者的相互調(diào)控關系。
　　結論：
　　1.發(fā)現(xiàn)miR-34a可作用于SH2B3的3'UTR區(qū)，從而調(diào)控其在心肌細胞中的表達。
　　2.在TGF-β1及缺