豬Hepcidin基因在畢赤酵母中的表達(dá)及活性研究.pdf

1、Hepcidin是一種富含半胱氨酸的小分子多肽，有一定的抑菌活性，同時(shí)具行調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝的功能，其潛在的醫(yī)用價(jià)值成為近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn)。但通過化學(xué)合成或從組織中提取獲得Hepcidin的成本相當(dāng)高且不容易操作，因此，利用生物學(xué)技術(shù)，采用微生物發(fā)酵手段在體外獲得大量Hepcidin小肽成為當(dāng)前的一個(gè)首選方法。
　　巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）是目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，具有易于操作培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、表

2、達(dá)量高、可以對(duì)外源基因進(jìn)行正確的翻譯后加工與修飾、糖基化程度低、表達(dá)菌株穩(wěn)定、可進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。
　　本試驗(yàn)根據(jù)畢赤酵母對(duì)密碼子的偏好性，在不改變Hepcidin氨基酸序列的前提下，對(duì)其基因序列進(jìn)行改造，并與真核表達(dá)載體pGAPZαA連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含25μg/mLZeocin抗生素的低鹽LB平板初步篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR檢測(cè)，EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定及DNA測(cè)序，證實(shí)插入片段的DNA序列與設(shè)計(jì)的豬

3、Hepcidin基因序列完全一致。將線性化的重組質(zhì)粒經(jīng)電擊導(dǎo)入畢赤酵母X-33中，采用含100μg/mLZeocin抗生素的YPD培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并通過提取酵母基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)。用含不同濃度Zeocin的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝重組酵母菌。將重組酵母擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集上清液，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在2.76kDa處有目的條帶，表明Hepcidin在畢赤酵母中成功表達(dá)。
　　采用液相生長(zhǎng)抑制法測(cè)定