豬Hepcidin基因在畢赤酵母中的表達及活性研究.pdf

1、Hepcidin是一種富含半胱氨酸的小分子多肽，有一定的抑菌活性，同時具行調(diào)節(jié)機體鐵代謝的功能，其潛在的醫(yī)用價值成為近年來研究的一個熱點。但通過化學合成或從組織中提取獲得Hepcidin的成本相當高且不容易操作，因此，利用生物學技術(shù)，采用微生物發(fā)酵手段在體外獲得大量Hepcidin小肽成為當前的一個首選方法。
　　巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）是目前應用最廣泛的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，具有易于操作培養(yǎng)、生長速度快、表

2、達量高、可以對外源基因進行正確的翻譯后加工與修飾、糖基化程度低、表達菌株穩(wěn)定、可進行高密度發(fā)酵等優(yōu)點。
　　本試驗根據(jù)畢赤酵母對密碼子的偏好性，在不改變Hepcidin氨基酸序列的前提下，對其基因序列進行改造，并與真核表達載體pGAPZαA連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，在含25μg/mLZeocin抗生素的低鹽LB平板初步篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR檢測，EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定及DNA測序，證實插入片段的DNA序列與設(shè)計的豬

3、Hepcidin基因序列完全一致。將線性化的重組質(zhì)粒經(jīng)電擊導入畢赤酵母X-33中，采用含100μg/mLZeocin抗生素的YPD培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并通過提取酵母基因組進行PCR檢測。用含不同濃度Zeocin的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝重組酵母菌。將重組酵母擴大培養(yǎng)，離心收集上清液，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示，在2.76kDa處有目的條帶，表明Hepcidin在畢赤酵母中成功表達。
　　采用液相生長抑制法測定