Megsin對糖尿病小鼠腎組織ERK及ECM作用的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabetic nephropathy， DN)是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一，它的危害巨大，不積極治療，最終可發(fā)展成終末期腎衰竭。糖尿病腎病在美國和歐洲已成為引起終末期腎病的最常見病因，約占終末期腎病接受透析的40％。2001年，對我國30個省市自治區(qū)住院患者的調查發(fā)現(xiàn)，DN患病率約為33％，因此探索DN的發(fā)病機制及防治策略成為目前廣大腎臟病學者關注的課題。
　　 研究認為，糖尿病腎病的發(fā)病機制與糖脂代謝紊亂、多元

2、醇通路激活、蛋白激酶C激活、高血壓所致的腎血流動力學改變、氧化應激、血管活性物質及細胞因子、遺傳因素等多因素有關。DN的病變特征是腎小球肥大，其病理學基礎是腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell， GMC)增殖、細胞外基質(extracellular matrix， ECM)積聚，從而導致腎小球高濾過和蛋白尿，最后導致腎小球硬化和腎間質纖維化。ECM的積聚是由于ECM合成增加和降解減少所致，多種原因，比如細胞

3、因子或生長因子等促進了系膜增殖、系膜細胞肥大和基質分泌增加。同時還存在著ECM降解減少，目前已知道參與ECM降解的酶主要有三類：絲氨酸蛋白酶、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）及半胱氨酸蛋白酶?；|金屬蛋白酶可以降解ECM中的Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型膠原。纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor, PAI-1)能夠抑制絲氨酸蛋白酶，使ECM降解減少。它

4、們的動態(tài)失衡直接參與了ECM的積聚。
　　 Megsin(mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin)是一種系膜細胞優(yōu)勢表達基因，屬serpin超家族成員，其能夠與絲氨酸蛋白酶結合，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶抑制劑活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病的系膜細胞中，其基因與蛋白表達水平顯著上調。提示megsin作為serpin的成員，必定參與了GMC的某些病理生理過程。糖尿

5、病腎病作為一種以系膜細胞增生和系膜基質積聚為主要病理改變的疾病，megsin基因怎樣參與糖尿病腎病的發(fā)病過程及其作用途徑如何目前尚未闡明。因此探討megsin在GMC細胞外基質合成與降解中的作用對于深入揭示糖尿病腎病的發(fā)生機制具有重要意義。
　　 本課題建立糖尿病CD-1小鼠模型并轉染Megsin基因，同時應用RNA干擾技術使megsin在小鼠腎臟組織中過表達或表達抑制，從整體、細胞和分子水平觀察megsin、血小板衍生生長因子

6、-BB(platelet-derived growth factor-BB， PDGF-BB)、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase， ERK1/2)、轉化生長因子β1(transforming growthfactor-β1， TGF-βi)、Ⅳ型膠原(collagenⅣ)等表達的變化，從而探討megsin在糖尿病腎病發(fā)病過程中可能的細胞信號傳導通路及

7、其對ECM合成的影響；通過細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（Extracellular matrix metalloproteinases inducer， EMMPRIN）、MMP-9及Ⅳ膠原表達的變化，探討megsin對高糖環(huán)境下系膜細胞ECM降解的影響；通過藥物干預，觀察吡格列酮(pioglitazone)對高糖環(huán)境中megsin、MMP-2、PAI-1及Ⅳ型膠原表達的影響，為進一步探討megsin在糖尿病腎損害中發(fā)病中的作用及其防治

8、提供新的途徑。
　　 方法：
　　 第一部分：選取清潔級健康雄性CD-1小鼠60只，行單側腎切除，2周后切口完全愈合。隨機抽取45只腹腔注射鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)150mg/kg制備糖尿病小鼠模型。將檢測成模的45只小鼠隨機分為三組，構建megsin表達質粒并經(jīng)尾靜脈注射轉染小鼠(D組，n=15)每周一次、單純糖尿病組(B組，n=15)、糖尿病+空質粒轉染組(C組，n=15)，將只做單側腎切除

9、的小鼠作為正常對照組（A組，n=15）。實驗共12周，在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及腎組織標本，檢測其血糖(BG)、血清肌酐(Scr)、小鼠腎重與體重比值(KW/BW)、尿蛋白(UP)。在2、4、12周末收集腎組織標本，分別應用免疫組化染色和蛋白印記法測定腎組織中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原的表達。建立穩(wěn)定表達megsin小鼠系膜細胞株，高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(D組)，同時設立小鼠系膜細胞

10、低糖培養(yǎng)組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組（B組，30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+轉染空質粒培養(yǎng)組（C組）和轉染megsin質粒+高糖+U0126組（E組），分別于12、24、48小時末收集各組細胞及上清，提取蛋白，應用免疫細胞化學染色測定細胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN的表達，應用蛋白印記法測定各組總蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表達，

11、放免法測定細胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度。
　　 第二部分：動物模型制備同第二部分，經(jīng)尾靜脈注射megsin siRNA質粒轉染CD-1糖尿病小鼠(D組)，每周注射1次，并設立糖尿病組(B組)、糖尿病+空質粒轉染組（C組），單側腎切除對照組(A組)，每組各15只小鼠，實驗共12周，在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及腎組織標本，檢測其BG、Scr)、小鼠腎重與體重比值(KW/BW)及UP。在2、4、12周末收集腎組織標本，分別應用

12、免疫組化染色和蛋白印記法測定腎組織中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原的表達。體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞，應用脂質體作為載體瞬時轉染megsin siRNA質粒，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時（D組，），并設立小鼠系膜細胞低糖培養(yǎng)組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組(B組，30mmol/L D-葡萄糖)、高糖+空質粒培養(yǎng)組（C組），于12、24、48小時末收集每組細胞和上清，提取蛋白，應用免疫細胞

13、化學染色測定細胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及纖維連接蛋白的表達，應用蛋白印記法測定各組總蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表達，放免法測定細胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度。
　　 第三部分：建立穩(wěn)定表達megsin的小鼠系膜細胞，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(D組)；應用脂質體2000作為載體瞬時轉染megsin siRNA質粒，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時，(E組)，并設立小

14、鼠系膜細胞低糖培養(yǎng)組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖培養(yǎng)組（B組，30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+空質粒培養(yǎng)組（C組），分別于12、24、48小時末收集各組細胞及上清，提取蛋白，應用免疫細胞化學染色測定細胞中megsin、EMMPRIN及MMP-9的表達，應用蛋白印記法測定各組megsin、EMMPRIN和MMP-9蛋白的表達，放免法測定細胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度。
　　 第四部分：取小鼠系膜細胞種植于96孔

15、板，采用MTT法分別檢測低糖、高糖及干預藥物吡格列酮對系膜細胞增殖狀態(tài)的影響。采用6孔板和25cm2塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞，將細胞分成3組：低糖組(A組，5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖組(B組，30mmol/L D-葡萄糖)、高糖+吡格列酮組(C組)，于48小時末收集各組細胞及上清，提取蛋白，應用免疫細胞化學染色測定細胞中megsin、EMMPRIN、MMP-2、PAI-1的表達，應用蛋白印記法測定各組總蛋白中megsin、EMMP

16、RIN、MMP-2、PAI-1的表達，放免法測定細胞上清液中Ⅳ型膠原的濃度（結果用總蛋白校正）。
　　 結果：
　　 第一部分：
　　 1.動物實驗：與A組相比，B組、C組小鼠在第4周時可見KW/BW、Scr、UP升高(P＜0.01)，D組升高更為明顯(P＜0.01);12周時，上述改變更加顯著。從第2周開始，光鏡下觀察B組、C組小鼠可見腎小球內(nèi)細胞數(shù)增多，腎小球體積稍增大，系膜區(qū)基質增多；PAS染色可見陽性紅染

17、物質增加，Masson染色可見膠原纖維增多；D組變化較B組、C組明顯；到12周末時上述變化更為顯著。免疫組化及蛋白印記結果顯示，與A組先比，第2周末即可見B組、C組、D組CD-1小鼠腎組織中megsin表達增強(P＜0.01)，D組與B、C組相比，表達更加明顯(P＜0.01)。B組、C組、D組隨著時間延長，megsin在腎組織的表達逐漸加強，至12周末表達最強，各時間點之間相比，具有統(tǒng)計學差異（P均＜0.01）。B組、C組、D組PDGF

18、-BB、pERK1/2、TGF-β1、FN及Ⅳ型膠原在第2周末表達增強，與A組相比具有統(tǒng)計學差異(P均＜0.01)，D組與B、C組相比，表達更加顯著（P均＜0.01）。B組、C組、D組隨著時間延長，上述指標在腎組織的表達逐漸加強，至12周末表達最強。蛋白印記檢測megsin、PDGF-BB、pERK1/2及TGF-β1蛋白在各組、各時間點表達的結果與免疫組化相一致。
　　 2.體外系膜細胞培養(yǎng)：免疫細胞化學結果顯示，高糖培養(yǎng)組（

19、B組）及轉染空質粒組（C組）從12h開始，megsin、PDGF-BB表達即開始增強，且隨時間表達有逐漸增強的趨勢，至48小時表達最強，與A組同時相相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)，兩組各時間點之間相比，megsin及PDGF-BB表達也具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。而經(jīng)轉染megsin質粒(D組)后，megsin及PDGF-BB表達在各時間點隨時間延長表達顯著增強，與B組各時相相比具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。經(jīng)過U

20、0126干預(E組)后發(fā)現(xiàn)，在各時間點與D組相比，megsin、PDGF-BB表達沒有顯著降低(P均＞0.05)。高糖培養(yǎng)組(B組)及轉染空質粒組(C組)從12h開始，pERK1/2、TGF-β1及FN表達即開始增強，且隨時間表達有逐漸增強的趨勢，至48小時表達最強，與A組同時相相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)，兩組組各時間點之間相比，三者表達也具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。而經(jīng)轉染megsin質粒（D組）后，pERK1/

21、2、TGF-β1及FN表達在各時間點隨時間延長表達顯著增強，與B組各時相相比具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。經(jīng)過U0126干預(E組)后發(fā)現(xiàn)，在各時間點與D組相比，三者表達顯著降低(P均＜0.01)。蛋白印記法檢測megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1蛋白在各組、各時間點表達與免疫細胞化學檢測結果相一致。細胞上清液Ⅳ型膠原測定結果顯示B組和C組上清液中Ⅳ型膠原含量隨時間延長逐漸增加，48h達高峰，與A組同時相相比，

22、其含量具有統(tǒng)計學差異(P均＜0.01)；D組與B組同時相相比，上清液中Ⅳ型膠原的含量則隨時間延長增加顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）；與D組同時相相比，E組其含量則顯著降低，具有統(tǒng)計學差異（P均＜0.01）。
　　 第二部分：
　　 1．動物實驗：B組、C組、D組小鼠注射ST24～5天后即出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)，而A組則無上述表現(xiàn)。B組、C組小鼠KW/BW、血清肌酐和UP在第2周開始升高，D組較A組略有下降，

23、但與A組相比差異無統(tǒng)計學意義；與A組相比，B組小鼠從第4周開始，KW/BW、血清肌酐、UP升高(P＜0.01)，C組升高更為明顯(P＜0.01)；D組與B組相比KW/BW、血清肌酐、UP下降(P＜0.01)，12周時，上述改變更加顯著。從第二周開始，光鏡下觀察B組、C組小鼠腎小球體積稍增大，基底膜普遍增厚，系膜區(qū)基質增多，D組變化較B組減輕；到12周末時上述變化更為顯著。免疫組化和蛋白印記結果顯示，與A組相比，B組從第二周開始，其腎小球

24、megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達增強(P＜0.01)；D組轉染megsin siRNA后，與B組相比腎小球megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達減弱，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；隨著時間的延長，與A組相比，B組腎小球megsin、pERK1/2、PDGF-BB、TGF-β1及Ⅳ型膠原表達進一步加強(P＜0.01)，12周是表達最強，D組上述各項指標較B組減

25、弱(P＜0.01)。B組和C組上述指標在各時間點相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2．細胞培養(yǎng)：免疫細胞化學及蛋白印記結果顯示，從12小時開始，B組較A組小鼠系膜細胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表達及蛋白水平開始升高(P＜0.01)，48小時達高峰，C組與B組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；D組與B組同期相比，megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表

26、達及蛋白水平減弱，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)；從12小時開始，與A組相比，B組小鼠系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（細胞總蛋白校正）開始升高，48小時達高峰(＜0.01)，C組與B組同期相比差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)，但D組與B組同期相比，系膜細胞上清液中Ⅳ膠原濃度顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 第三部分：免疫細胞化學及蛋白印記結果顯示，與A組相比，從12小時開始，B組小鼠系膜細胞megsin表達及蛋白

27、水平開始升高(P＜0.01)，48小時達高峰，C組與B組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；D組與B組同期相比，megsin表達及蛋白水平升高更加明顯(P＜0.01)；E組與B組、D組同期相比，megsin表達及蛋白水平均顯著減弱(P＜0.01)；從12小時開始，B組較A組EMMPRIN、MMP-9表達及蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，48小時達高峰，C組與B組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；D組與B組同期相比

28、，EMMPRIN、MMP-9表達及蛋白水平下降更加明顯，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)；E組與B組、D組同時相相比，EMMPRIN及MMP-9表達明顯增強及蛋白水顯著升高(P＜0.01)；從12小時開始，與A組相比，B組小鼠MC上清液中Ⅳ型膠原濃度（細胞總蛋白校正）開始升高，48小時達高峰(＜0.01)，D組與B組相比，MC上清液中Ⅳ膠原濃度升高更明顯(P＜0.01)，E組與B組、D組同期相比，系膜細胞上清液中Ⅳ膠原濃度則有顯著性下降，

29、差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 第四部分：免疫細胞化學及蛋白印記結果顯示，與A組相比，48h時B組小鼠系膜細胞megsin、PAI-1表達及蛋白水平升高(P＜0.01)，C組與B組同期相比，megsin及PAI-1表達減弱及蛋白水平降低(P＜0.01);B組較A組EMMPRIN、MMP-2表達減弱及蛋白水平下降(P＜0.01)，C組與B組同期相比，EMMPRIN、MMP-9表達增強及蛋白水平升高，具有統(tǒng)計學差異(P＜

30、0.01)；與A組相比，B組小鼠系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（細胞總蛋白校正）升高(＜0.01)，C組與B組同期相比，系膜細胞上清液中Ⅳ膠原濃度明顯下降(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.動物實驗及細胞培養(yǎng)研究表明，糖尿病狀態(tài)下megsin基因在腎小球表達增強，與腎小球系膜增殖及ECM積聚相一致，提示megsin在糖尿病小鼠腎損害的發(fā)病機制中具有一定的作用。
　　 2.過表達的megsin可促進糖尿病小鼠

31、腎組織或系膜細胞ECM積聚，其作用機制一方面可能是通過PDGF-BB誘導的ERK通路激活，TGF-β1表達增加，使FN的表達及Ⅳ型膠原的含量增加而實現(xiàn)的；另一方面過表達的megsin可抑制糖尿病小鼠腎組織或系膜細胞EMMPRIN、MMP-9的表達，導致了ECM的降解減少，從而參與了糖尿病小鼠腎損害的發(fā)病過程。
　　 3.megsin siRNA和吡格列酮可下調糖尿病小鼠腎組織或系膜細胞megsin基因的表達，通過抑制ERK通路轉