腎康丸對糖尿病腎病大鼠的腎保護(hù)作用及對miR-192信號通路的影響.pdf

1、糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，目前DN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，亦缺乏有效的治療手段。因此，有效地預(yù)防、治療DN已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中極為重要的問題。 DN的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果。其中miRNAs作為一類小分子非編碼RNA，由于其存在的普遍性以及所參與的調(diào)控過程的復(fù)雜性，成為近年來研究的熱點(diǎn)。已有研究顯示miRNAs在糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)病中起重要作用。miR-192

2、作為在腎臟特異性表達(dá)的miRNA之一，可以經(jīng)由其TGF-β1介導(dǎo)通路參與DN的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白蓄積進(jìn)程，可能機(jī)制為：TGF-β1正調(diào)節(jié)miR-192，miR-192減量調(diào)節(jié)SIP1，導(dǎo)致CollgenⅠ過度表達(dá)，蛋白蓄積。SIP1的3'UTR為miR-192調(diào)控靶點(diǎn)，miR-192通過mRNA降解途徑減少SIP1表達(dá)。TGF-β1誘導(dǎo)miR-192表達(dá)的機(jī)制尚待進(jìn)一步探討，有證據(jù)顯示miR-192啟動子存在高度保守的上游區(qū)est

3、-1原癌基因結(jié)合位點(diǎn)，而TGF-β1也誘導(dǎo)調(diào)控est-1表達(dá)，est-1在腎臟發(fā)育、保持腎小球完整性及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)中都是必需的，由此推斷，TGF-β1可能是通過est-1調(diào)控miR-192。 西醫(yī)在治療DN上主要是控制高血糖、減少蛋白尿、控制高血壓等對癥治療，但迄今尚未有能完全阻斷DN進(jìn)展的藥物。因此，發(fā)揮中醫(yī)藥治療特色和優(yōu)勢，積極探求中醫(yī)藥治療DN的有效方法，防止或延緩其發(fā)展具有重要的意義。 本課題通過動物實(shí)驗(yàn)，

4、從miR-192及其TGF-β1介導(dǎo)途徑出發(fā)，探討腎康丸治療DN的分子基因水平的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體如下： 第1部分:腎康丸對DN大鼠的腎臟保護(hù)作用 目的：觀察腎康丸對DN大鼠模型的治療及腎臟保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究藥物作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：首先用鏈脲佐菌素（STZ）按55 mg·kg-1大鼠體重一次性腹腔內(nèi)注射法建立大鼠DM模型，連續(xù)喂養(yǎng)2周，測血糖、尿蛋白、尿量。若血糖值>16．6m

5、mol/L、尿量>原尿量150%、尿蛋白排泄>30 mg/kg/24h，則造模成功，計(jì)算成模率。大鼠造模成功后，稱重，隨機(jī)分為4組：模型對照組、腎康丸組、開博通組和胰島素組，另設(shè)正常對照組。腎康丸組大鼠實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定為1．1 g·kg-1大鼠體重，腎康丸研磨后用蒸餾水配成0．22 g·mL-1混懸液。開博通片組大鼠實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定為4．5 mg·kg-1大鼠體重，開博通片研磨后用蒸餾水配成0．9 mg·mL-1溶液。腎康丸組和開博通組大鼠按5

6、mL·kg-1體重，灌服相應(yīng)藥液；模型對照和正常對照組大鼠灌服等容積生理鹽水。每日1次，連續(xù)8w。胰島素組以血糖11．1mmol/L為基準(zhǔn)每日皮下注射胰島素8～40u控制血糖。各組大鼠自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)中除胰島素組外，其他各組不予任何降血糖藥物。治療8周，治療期間及治療后觀察大鼠一般狀況、血糖、尿糖。末次給藥后計(jì)24h尿量和飲水量，然后用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動脈穿刺采血，分離血清，全自動生化分析儀檢測大鼠血尿素氮（BUN）、

7、血肌酐（Scr）、血總膽固醇（TC）、血甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）；用紫外分光光度法檢測糖化血紅蛋白（GHb）；放免法檢測血清胰島素和血清胰高血糖素含量與血栓素（TXB2）、6-酮-前列環(huán)素（6-keto-PGF1a）、內(nèi)皮素（ET）；考馬斯亮蘭法檢測24h尿蛋白（Upro）；取大鼠腎臟，觀察腎臟大小，計(jì)算腎重、相對腎重，并通過HE染色法觀察大鼠腎臟組織病理變化。 結(jié)果：

8、 1．55只大鼠用于造模，成模率80%（44/55），成模后病死率4．55%（2/44）。 2．8周治療期間，模型組大鼠血糖均維持在16．7 mmol·L-1以上，尿糖+++以上；表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的DM癥狀，腎康丸、開博通及胰島素治療組大鼠一般情況均較模型對照有所改善； 3．正常對照組及各治療組大鼠體重均較治療前增加（P<0．01），模型對照組大鼠體重未增，且較各治療組降低（P<0．01）。

9、4．與正常對照組比較，各組大鼠血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c、胰高血糖素均升高，24h尿量及飲水量增加；與模型對照組比較，腎康丸、開博通及胰島素治療均可以降低24hUpro、BUN及24h尿量及飲水量；腎康丸與胰島素治療可以降低血糖、GHb和胰高血糖素（P<0．01）。僅腎康丸組TC、TG、LDL-c明顯下降（P<0．01）。 5．與正常對照組比較，各組大鼠HDL-c、胰島素水平顯著降低（P

10、<0．01）。僅腎康丸治療組與模型對照組相比，對HDL-c具有顯著升高作用（P<0．01）；腎康丸與胰島素治療均可提高胰島素水平（P<0．01）。 6．與正常對照組比較，DM各組大鼠TXB2、 ET水平均顯著升高，6-keto-PGF1a均顯著降低（P<0．01）。而較之模型組，腎康丸組TXB2、 ET水平明顯下降（P<0．01），對6-keto-PGF1a腎康丸組則有顯著的恢復(fù)作用（P<0．01）。開博通、胰島素治療對上述指標(biāo)

11、無改善。（P>0．05） 7．與正常對照組比較，模型組大鼠腎重及相對腎重增加（P<0．01），且出現(xiàn)了相當(dāng)于Mogensen分期的3期左右DN病理損害。腎康丸、開博通和胰島素組病理改變較模型組均有不同程度的減輕，其中腎康丸組效果更為顯著。 結(jié)論： 1．腎康丸能夠改善實(shí)驗(yàn)性DN大鼠一般狀態(tài)，具有一定的調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝的作用。 2．腎康丸能夠促進(jìn)胰島素分泌，降低胰高血糖素。 3．腎康丸能夠降低實(shí)驗(yàn)性

12、DN大鼠尿蛋白，抑制血清BUN及Scr，具有一定的保護(hù)腎功能作用。 4．腎康丸能夠降低TXB2水平，提高6-keto-PGF1a水平，恢復(fù)TXB2與6-keto-PGF1a的平衡。 5．腎康丸能夠降低血漿ET水平，緩解血管內(nèi)皮損傷。 6．腎康丸能夠改善腎臟組織病理學(xué)改變，在一定程度上緩解腎臟病理損傷。 第2部分:腎康丸對DN大鼠miR-192信號通路的影響 目的：探討腎康丸對DN大鼠腎臟miR-1

13、92及其TGF-β1介導(dǎo)通路的影響。 方法：取第一部分各組大鼠左腎組織，沿正中矢狀面剖開，用PBS沖洗干凈，除去包膜，投入10%甲醛中性緩沖液中固定，應(yīng)用SP（過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素Streptavidin/Peroxidase）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，分別以兔抗大鼠TGF-β1、Collagen1和SIP1多克隆抗體為一抗，檢測腎臟組織TGF-β1、Collagen1和SIP1蛋白的表達(dá)。取第一部分各組大鼠右腎組織，PBS

14、沖洗干凈后，-70℃凍藏，20mg左右腎組織冰浴中勻漿后溶解于300μL裂解液RL中，按試劑盒說明書提取總RNA。取1．5μg總RNA采用M-MLV轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTM在FTC-2000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR，內(nèi)參照采用GAPDH，檢測腎臟組織TGF-β1、Collagen1、SIP1和miR-192 mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1．正常組大鼠腎臟在腎小管上皮細(xì)胞中

15、有少量TGF-β1蛋白表達(dá)；與正常組大鼠相比，模型組在腎小管上皮細(xì)胞和髓質(zhì)的TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯增加；與模型組相比較，腎康丸、開博通和胰島素治療可以減少TGF-β1蛋白表達(dá)，其中腎康丸組效果更明顯。 2．Collagen1蛋白在正常組腎小球內(nèi)無表達(dá)，在腎小囊、腎小管散在表達(dá)；模型組則在腎小球內(nèi)、腎小囊、腎小管表達(dá)增加；腎康丸組、開博通組和胰島素組腎小球內(nèi)無表達(dá)，腎小囊、腎小管表達(dá)量較模型組減少。 3．SIP1蛋白在

16、正常組腎小囊內(nèi)無表達(dá)，在腎小球、腎小管、腎髓質(zhì)表達(dá)明顯；模型組表達(dá)量減低；腎康丸、開博通和胰島素治療后可以增強(qiáng)SIP1表達(dá)。 4．與正常組比較，模型組大鼠腎臟TGF-β1、Collagen1、miR-192 mRNA表達(dá)量增加，而SIP1 mRNA表達(dá)降低：腎康丸組與開博通組可以降低TGF-β1、Collagen1、miR-192 mRNA表達(dá)，提高SIP1 mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 1．腎康丸可以降低造模后升高的

17、TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)； 2．腎康丸可以下調(diào)Collagen1mRNA和蛋白表達(dá)； 3．腎康丸可以上調(diào)DN降低的SIP1mRNA和蛋白表達(dá)； 4．腎康丸可以降低造模后升高的miR-192的表達(dá)。 全文結(jié)論：本研究通過DN動物模型實(shí)驗(yàn)研究，再次證明腎康丸具有治療DN和保護(hù)腎臟的作用；其作用機(jī)理與藥物抑制miR-192及其TGF-β1介導(dǎo)通路的活性，減少ECM的分泌與基因合成有關(guān)。為腎康丸應(yīng)用于DN