1,25-(OH)2D3對豬成釉細胞生物學特性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 隨著分子生物學和組織工程學的發(fā)展，目前牙齒再生已經成為國內外研究的熱點。牙齒再生組織工程包括單純構建和全牙重建：單純構建是將形成牙齒某一部分的細胞與相應支架材料復合后植入動物體內而成，目前此方面的研究已經取得一定進展；而全牙重建很復雜，涉及多種牙齒形成細胞的復合和不同類型支架材料的組合，這類研究進展緩慢。牙釉質是脊椎動物體內最硬的組織，模擬牙釉質的礦化過程，生產出具有再礦化能力的生物義齒一直是牙科醫(yī)生的夢想。目

2、前，生物礦化形成牙釉質的過程仍然建立在成釉細胞和蛋白質的相互作用基礎上。成釉細胞是牙釉質的形成細胞，釉原蛋白(Amelogenin，AMEL)是釉質有機基質的主體，AMEL對釉質礦化的起始、晶核的形成及排列等諸多因素起著重要的調節(jié)作用。非AMEL包括釉蛋白和成釉蛋白(Ameloblastin，AMBN)等也被認為具有較廣泛的促進晶體成核和影響晶體生長形態(tài)的作用。故任何影響成釉細胞生長及其蛋白質分泌的因素均能影響牙釉質的礦化過程。

3、　　 1，25-(OH)2D3作為維生素D甾體類激素的活化形式，對細胞的生長、分化及蛋白質的分泌等起著重要的調控作用，其受體在口腔組織中分布廣泛，其中成釉細胞是VD的靶細胞之一。國外學者通過RT-PCR及Northern Blot等方法研究發(fā)現成釉細胞所分泌的AMEL的表達受1，25-(OH)2D3調控。然而，RT-PCR及Northern Blot均是從轉錄水平上檢測目的基因，而非翻譯水平，從轉錄水平到翻譯水平還有復雜的過程，因此基

4、因的表達量與蛋白的表達量不一定呈正相關.本研究通過體外培養(yǎng)豬成釉細胞，應用Western Blot法在蛋白質水平上檢測不同濃度以及不同作用時間下的1，25-(OH)2D3對豬成釉細胞所分泌的特異性蛋白-AMEL及AMBN表達變化的影響，為牙釉質生物礦化的研究奠定實驗基礎。
　　 目的：
　　 1.分離培養(yǎng)豬成釉細胞，為進一步的研究提供實驗基礎。
　　 2.研究1，25-(OH)2D3在不同濃度以及不同作用時間下對

5、體外培養(yǎng)的豬成釉細胞增殖的影響。
　　 3.在翻譯水平上研究1，25-(OH)2D3在不同濃度以及不同作用時間下對體外培養(yǎng)的豬成釉細胞所分泌的特異性蛋白-AMEL及AMBN表達變化的影響。
　　 方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)：選擇約6月齡30kg重的西藏小型豬，無菌條件下取出磨牙牙胚，分離牙囊、牙乳頭及成釉器。將成釉器組織剪成約1mm3大小的組織塊，采用組織塊法原代培養(yǎng)，酶消化法進行傳代培養(yǎng)。
　　 2.細

6、胞鑒定：通過免疫細胞化學方法檢測所培養(yǎng)細胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達，對細胞來源進行初步鑒定。采用成釉細胞特異性蛋白-AMEL抗體對培養(yǎng)細胞進行定性。
　　 3.濃度梯度的1，25-(OH)2D3(0、1×10-10、1×10-8、1×10-6mol/L)作用于體外培養(yǎng)的豬成釉細胞，分別在加藥后1天、3天、5天，利用MTT法檢測細胞的增殖情況。
　　 4.濃度梯度的1，25-(OH)2D3(0、1×10-10、1×10-

7、8、1×10-6mol/L)作用于體外培養(yǎng)的豬成釉細胞，分別在加藥后1天、3天、5天，用Western免疫印跡檢測其分泌的AMEL及AMBN的表達水平。
　　 結果：
　　 1.細胞形態(tài)學特征：豬成釉細胞呈上皮細胞樣，細胞形態(tài)多樣，呈圓形或多角形等，可見多核、絲狀偽足、鋸齒狀邊緣。部分細胞含有明顯的顆粒樣物質，可能為星網層細胞。在卵圓形的上皮細胞中間可見大細胞樣細胞，而不像成纖維細胞(長梭形，胞體較小，胞核較大，居中，核

8、仁清晰)，在培養(yǎng)過程中隨著細胞培養(yǎng)時間及代數的增長，大細胞樣細胞逐漸盛行且不能繼續(xù)增殖。
　　 2.免疫細胞化學染色結果顯示細胞角蛋白-14染色胞漿呈棕黃著色，陽性，而波形絲蛋白染色胞漿無著色，陰性，表明該細胞為上皮來源。細胞特異性抗AMEL抗體染色胞漿呈棕黃著色，陽性，表明該細胞為成釉細胞。
　　 3.MTT檢測結果顯示，在同一作用時間點上，1，25-(OH)2D3在1×10-10～1×10-6mol/L濃度范圍內對豬

9、成釉細胞的增殖均有明顯的抑制作用，其中1×10-6mol/L組作用最強，1×10-10mol/L組作用最弱，各實驗組與對照組之間，各實驗組之間均相差顯著(P<0.05)。在相同濃度的1，25-(OH)2D3作用下，隨作用時間的增長，1，25-(OH)2D33抑制細胞增殖的作用也逐漸增強，細胞增殖趨勢明顯減緩，各實驗組之間均相差顯著(P<0.05)，呈現一定的時間依賴性。
　　 結論：
　　 4.Western Blot檢

10、測結果顯示，在相同濃度的1，25-(OH)2D3作用下，隨作用時間的增長，AMEL及AMBN的表達均增強，各實驗組之間均相差顯著(P<0.05)；在同一作用時間點上，隨1，25-(OH)2D3濃度的升高，AMEL的表達逐漸增強，而AMBN的表達逐漸減弱。各實驗組與對照組之間，各實驗組之間均相差顯著(P<0.05)。
　　 5.豬成釉細胞在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中生長良好，且可在較長時間內維持其上皮樣形態(tài)和生物學