BEZ235抑制胰腺癌細胞遷移與浸潤的機制及SIX1蛋白表達與胰腺癌臨床特點關系的研究.pdf

1、目的：胰腺癌以惡性程度高、發(fā)展快、預后差而聞名，在歐美國家列惡性腫瘤死亡率的第四位，在我國該病發(fā)病率及死亡率迅速上升，列惡性腫瘤死亡率的第六位，但其發(fā)病機制至今未明，治療方面尚無突破性進展。因此，對胰腺癌分子生物學基礎進行深入研究非常重要。本文研究 PI3K/Akt的選擇性抑制劑 NVP-BEZ235(BEZ235)體外抑制胰腺癌細胞的作用及其分子機制，為胰腺癌的生物學治療提供可能的分子靶點；同時研究SIX1蛋白表達在胰腺癌生物學行為判

2、定中的臨床意義。
　　材料與方法：體外培養(yǎng)胰腺癌 Panc-1細胞，并用不同濃度 BEZ235刺激Panc-1細胞。首先應用MTT法檢測BEZ235對Panc-1細胞的抑制作用；用倒置顯微鏡觀察 BEZ235對 Panc-1細胞形態(tài)學的影響；用劃痕、transwell等實驗驗證 BEZ235對 Panc-1細胞的遷移、浸潤的影響；用 Affymetrix GeneChip微陣列分析觀察轉移相關因子Ezrin和SIX1在Panc-1

3、細胞中BEZ235處理前后異常表達；利用 Western blotting方法、免疫熒光法檢測 BEZ235處理前后遷移相關因子 Ezrin蛋白的以及血管生成相關因子 SIX1蛋白的表達及 SIX1蛋白定位情況。另外，應用免疫組化方法檢測了 SIX1蛋白在103例胰腺癌組織以及45例正常胰腺組織中的表達，并分析了其臨床意義。
　　結果：
　　1. BEZ235可抑制胰腺癌 Panc-1細胞中的PI3K/Akt信號通路。應用梯

4、度濃度 BEZ235處理 Panc-1細胞48小時后發(fā)現(xiàn)：與未處理組比較，p-Akt在50 nM處理組開始表達下降，并呈現(xiàn)濃度依賴現(xiàn)象，提示 BEZ235可以抑制Panc-1細胞中的PI3K/Akt信號通路。
　　2. BEZ235可抑制Panc-1細胞增殖。MTT法檢測結果表明BEZ235影響Panc-1細胞生存能力，在250 nM,500 nM及1000nM BEZ235處理48 h時抑制明顯。并分別用100 nM,250 n

5、M及500 nM BEZ235處理48 h后，應用倒置顯微鏡觀察給藥前和給藥后 Panc-1細胞的形態(tài)，給藥前飽滿、緊密的Panc-1細胞給藥后表現(xiàn)出分散、變形、排列紊亂及死亡，呈 BEZ235濃度依賴性。
　　3. BEZ235可抑制 Panc-1細胞的遷移和浸潤。劃痕實驗結果表明：與未給藥的對照組相比，BEZ235藥物處理24 h、48 h、72h后，Panc-1細胞的遷移能力明顯受到抑制。Transwell實驗結果證明：與未

6、給藥的對照組相比，250 nM BEZ235藥物處理48 h后，Panc-1細胞的浸潤能力明顯受到抑制。Western blotting結果證明：轉移相關因子 Ezrin和磷酸化 Ezrin(p-Ezrin)的表達量呈濃度依賴性下降，而且其上游的SIX1蛋白表達水平也呈明顯地濃度依賴性下降；此外，免疫熒光實驗也證實： BEZ235可抑制 Panc-1細胞中Ezrin及其上游SIX1蛋白的表達。
　　4. BEZ235明顯抑制Ezr

7、in和SIX1基因表達。利用 Affymetrix GeneChip微陣列分析得到的結果明確，在諸多轉移相關因子中，BEZ235處理前后 Ezrin和 SIX1在 Panc-1細胞中存在顯著表達異常，且Ezrin和SIX1表達量呈濃度依賴性下降。
　　5. SIX1蛋白過表達提示胰腺癌患者的不良預后。免疫組化結果顯示：與正常胰腺組織相比，SIX1蛋白在胰腺癌組織中表達明顯增強，且 SIX1蛋白過表達與胰腺癌不良預后明顯相關，即 S