iNOS mRNA在慢性鼻竇炎鼻內(nèi)鏡術后組織中的表達及意義.pdf

1、慢性鼻竇炎是一種很常見的鼻部疾病.其病因目前認為是鼻部微環(huán)境的炎癥反應,其發(fā)病多認為是多因素多步驟共同作用的結果.慢性鼻竇炎治愈標準應是粘膜炎癥的徹底消除.雖然目前功能性鼻內(nèi)鏡鼻竇手術對治療慢性鼻竇炎的有效性已被臨床實踐所證明,但是鼻內(nèi)鏡手術后鼻粘膜上皮的創(chuàng)傷修復是一個復雜的過程.如何減輕術后鼻粘膜炎癥的持續(xù)狀態(tài),加快粘膜上皮的創(chuàng)傷修復是現(xiàn)今鼻內(nèi)鏡外科急需解決的棘手問題.NO屬于神經(jīng)遞質(zhì)等富反應性的極小氣體分子,在炎癥和免疫反應中發(fā)揮著

2、重要作用.NO是在一氧化氮合酶(NOS)作用下合成的.NOS分3型:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘發(fā)型NOs(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS).nNOS和eNOS統(tǒng)稱為結構型,主要調(diào)節(jié)生理功能.INOS主要在病理情況下產(chǎn)生,在疾病的發(fā)病和病理過程中起重要作用.iNOS在多種細胞內(nèi)表達,受炎癥因子刺激后活化產(chǎn)生大量一氧化氮,NO通過其細胞毒性作用損傷細胞,增加微血管通透性,抑制血小板聚集及粘附等作用,從而促進組織水腫形成. 本文應用原

3、位雜交技術,測定iNOS mRNA在慢性鼻竇炎鼻內(nèi)鏡術后組織中的分布和表達水平,探討NO和iNOS在慢性鼻竇炎手術后鼻粘膜上皮的創(chuàng)傷修復過程中的作用和臨床意義. 一.材料和方法 1.實驗材料收集2006年在浙江大學附屬第一醫(yī)院接受鼻內(nèi)鏡手術并進行復診的慢性鼻竇炎(Ⅱ型)患者,共30例,其中Ⅱ型1期3例Ⅱ型,2期15例, Ⅱ型3期12例.根據(jù)復診時間,分為三組,分別為術后一月組、術后三月組、術后六月組.各例患者在鼻內(nèi)鏡復診

4、時取鉤突切除后的切緣中部的組織,直徑約0.5cm.及時石蠟包埋,分批進行原位雜交.另選8例Ⅱ型慢性鼻竇炎患者的息肉組織和5例健康人的鼻粘膜作為對照組. 2.實驗方法(1)取手術切除的新鮮標本,用4﹪多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)(含1/1000的DEPC)固定一小時. (2)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋.切片,厚度8μm. (3)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水.30﹪H

5、<,2>O<,2> 1份+蒸餾水10份混合,室溫10分鐘以滅活內(nèi)源性酶.蒸餾水洗3次,每次5分鐘. (4)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3﹪檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3﹪檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶,混勻),37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化30分鐘.原位雜交用PBS洗3次×5分鐘.蒸餾水洗1次×5分鐘. (5)后固定:固定液為1﹪多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含

6、有1/1000 DEPC.室溫固定10分鐘.蒸餾水洗滌3次×5分鐘 (6)預雜交:按每張切片20μι加預雜交液.恒溫水浴箱42℃4小時.吸取多余液體,不洗. (7)雜交:按每張切片20 μι雜交液,加在切片上.將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后,蓋在切片上.恒溫箱42℃雜交過夜. (8)雜交后洗滌:揭掉蓋玻片,原位雜交用PBS洗3次×15分鐘.

7、 (9)滴加封閉液:37℃恒溫水浴箱30分鐘.甩去多余液體,不洗. (10)滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃恒溫水浴箱90分鐘.原位雜交用PBS洗5分鐘×4次.C (11)滴加SABC:37℃恒溫水浴箱30分鐘.原位雜交用PBS洗5分鐘×3次. (12)滴加生物素化過氧化物酶:37℃恒溫水浴箱20分鐘.原位雜交用PBS洗5分鐘×4次.

8、 (13)DAB顯色:顯色15分鐘,充分水洗5分鐘. (14)蘇木素復染30秒,充分水洗15分鐘. (15)干燥后,中性樹膠封片,鏡檢. 二.結果 顯微鏡下見原位雜交陽性的細胞胞漿著色呈棕黃色,而陰性細胞的胞漿則呈普通的淡藍色.正常鼻黏膜組可見iNOS mRNA陽性細胞主要分布在黏膜下,數(shù)量極少.Ⅱ型慢性鼻竇炎息肉組可見陽性細胞在黏膜下腺體周圍及血管周圍均有大量分布.

9、Ⅱ型慢性鼻竇炎術后一月組及三月組中可見陽性細胞在黏膜下腺體及血管周圍有分布,Ⅱ型慢性鼻竇炎術后六月組可見iNOS mRNA陽性細胞主要分布在黏膜下,數(shù)量極少. 在400倍光鏡下,觀察并計數(shù)切片中陽性表達的細胞.iNOS mRNA陽性細胞在正常鼻黏膜和慢性鼻竇炎鼻息肉組織及慢性鼻竇炎鼻內(nèi)鏡手術后組織中都有陽性表達.在正常鼻黏膜組織中,iNOS mRNA的陽性細胞率為(1.18±0.24)﹪;在Ⅱ型慢性鼻竇炎的組織中,iNOs mR

10、NA的陽性細胞率為(18.43±4.31)﹪;在Ⅱ型慢性鼻竇炎術后一月組織中,iNOS mRNA的陽性細胞率為(15.40±1.64)﹪; 在Ⅱ型慢性鼻竇炎術后三月組織中,iNoS mRNA的陽性細胞率為(8.34±0.78)﹪;在Ⅱ型慢性鼻竇炎術后六月組織中,iNOS mRNA的陽性細胞率為(1.31±0.27)﹪.Ⅱ型慢性鼻竇炎息肉組iNOS mRNA陽性細胞率較正常的鼻黏膜組明顯升高,t檢驗,p<0.05,差異有顯著性意義.Ⅱ型慢

11、性鼻竇炎術后一月組iNOS mRNA陽性細胞率較II型慢性鼻竇炎組無明顯降低,p>0.05,差異無顯著性意義.Ⅱ型慢性鼻竇炎術后三月組iNOS mRNA陽性細胞率較II型慢性鼻竇炎組明顯降低,t檢驗,p<0.05,差異有顯著性意義:較Ⅱ型慢性鼻竇炎術后一月組明顯降低,t檢驗,p<0.05,差異有顯著性意義;較正常的鼻黏膜組明顯升高,t檢驗,p<0.05,差異有顯著性意義.Ⅱ型慢性鼻竇炎術后六月組iNOS mRNA陽性細胞率較Ⅱ型慢性鼻竇

12、炎術后一月組明顯降低,t檢驗,p<0.05,差異有顯著性意義;較Ⅱ型慢性鼻竇炎術后三月組明顯降低,t檢驗,p<0.05,差異有顯著性意義;較正常鼻黏膜組無明顯升高,t檢驗,p>0.05,差異無顯著性意義. 三.結論 1)在正常鼻粘膜中可有iNOS mRNA陽性低表達,說明iNOS這種低表達是維持正常鼻腔生理功能所必需的. 2)本檢測中Ⅱ型慢性鼻竇炎息肉組織以及術后一月組織、三月組織中中iNOS mRNA陽性細胞率

13、較正常的鼻黏膜組織明顯升高,并且有統(tǒng)計學意義,這說明了iNOS和NO在慢性鼻竇炎以及術后粘膜炎癥持續(xù)狀態(tài)的發(fā)病機制中起到一定的作用. 3)本檢測中Ⅱ型慢性鼻竇炎術后一月組織、三月組織、六月組織之間iNOSmRNA陽性細胞率有顯著差異,并隨術后時間推延表達逐漸減少.說明NOS表達的增加和隨后引起的NO釋放可能在慢性鼻竇炎以及術后粘膜炎癥持續(xù)狀態(tài)的發(fā)病機制中起到一定的作用.Ⅱ型慢性鼻竇炎術后一月組織中iNOS mRNA陽性細胞率較Ⅱ