鹽酸小檗堿對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎的療效及機(jī)制研究.pdf

1、本文采用乳腺炎患牛乳樣中分離的金黃色葡萄球菌建立小鼠乳腺炎模型；并探索中藥單體鹽酸小檗堿對(duì)小鼠乳腺局部及相關(guān)炎癥因子的影響，初步探索其作用機(jī)制，為研究開(kāi)發(fā)中藥防治奶牛乳腺炎提供新的思路和方法。 小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎模型的建立：泌乳8～10d的BALB/c小鼠隨機(jī)分成健康對(duì)照組、生理鹽水組和3個(gè)不同劑量的接菌組。健康對(duì)照組：不做任何處理；50μL滅菌生理鹽水、1.0×10<'2>CFU/50μL、5.0x10<'2>CFU/5

2、0μL和1.0×10<'3>CFU/50μL細(xì)菌懸液分別經(jīng)乳頭管注入生理鹽水組和3個(gè)不同劑量接菌組小鼠的第四對(duì)乳腺內(nèi)(雙側(cè))。接菌后24h處死小鼠，取部分乳腺進(jìn)行組織學(xué)觀察，部分乳腺勻漿測(cè)定金黃色葡球菌數(shù)及ELISA測(cè)定TNF-α、IFN-γ含量。1.0×10<'2>CFU/50μL，接菌組乳腺腺泡結(jié)構(gòu)基本完整，局部視野有上皮細(xì)胞脫落，毛細(xì)血管輕度充血。5.0x10<'2>CFU/50μL接菌組乳腺腺泡局部崩潰嚴(yán)重，少量腺上皮壞死、脫落

3、，小毛細(xì)血管充血.、少量出血，間質(zhì)輕度水腫，腺泡內(nèi)、間質(zhì)中有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。1.0×10<'3>CFU/50μL，接菌組乳腺病變進(jìn)一步加重。各接菌組母鼠乳腺組織細(xì)菌數(shù)、TNF-α和INF-γ含量隨接菌劑量的增加而上升(P<0.01)。結(jié)果表明：各接菌量均可誘發(fā)小鼠乳腺炎。但1.0×10<'2> CFU/50μL，接菌組乳腺組織病理變化較輕，.5.0x10<'2>CFU/50μL接菌組乳腺組織病理變化較明顯，較1.0×10<'3>CFU

4、/50μL接菌組乳腺組織病理變化輕微，易于進(jìn)一步監(jiān)控乳腺的病理變化及藥物的治療作用效果。因此本試驗(yàn)選用5.0x10<'2>CFI/50μL，作為造模劑量。 鹽酸小檗堿的體外抑菌試驗(yàn)：按照試管二倍稀釋法測(cè)得純度在97％以上的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)奶牛乳腺炎臨床分離的金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為0.24mg/mL，0.56mg/mL。 鹽酸小檗堿對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎的作用及機(jī)制：泌乳8～10d的BALB/c小鼠隨機(jī)

5、分為4組：(A)生理鹽水組，(B)模型組，?低劑量治療組(0.5mg/mL)和(D)高劑量治療組(1.0mg/mL)。A組經(jīng)乳頭管注入滅菌生理鹽水50μL；B、C、D組分別經(jīng)乳頭管注入5.0x10<'2>CFU/50μL細(xì)菌懸液各50gL。A、B組于接菌后0h、12h、24h、36h腹腔注入滅菌生理鹽水各0.2mL；C、D組分別于接菌后0h、12h、24h、36h腹腔注入0.5mg/mL、1.0mg/mL的鹽酸小檗堿溶液各0.2mL。各

6、組于接菌或注射生理鹽水后12h、24h、36h、48h，摘眼球采血后處死小鼠。取部分乳腺進(jìn)行組織學(xué)觀察、改良甲苯胺藍(lán)染色觀察乳腺肥大細(xì)胞的變化，部分乳腺勻漿測(cè)定金黃色葡球菌數(shù)，ELISA測(cè)定乳腺勻漿及血清TNF-α、IFN-γ含量。結(jié)果表明：接菌24h后，與模型組相比，低劑量治療組和高劑量治療組均能減少乳腺內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。接菌48h后，模型組乳腺腺泡大部分崩潰，嗜中性粒細(xì)胞逐漸減少；治療組乳腺腺泡病變減輕，PMN浸潤(rùn)少于模型組。與

7、模型組相比，低劑量治療組、高劑量治療組在接菌后細(xì)菌數(shù)均極顯著低于模型組(P<0.01)，低劑量治療組細(xì)菌數(shù)顯著高于高劑量治療組(P<0.05)。模型組和治療組小鼠乳腺內(nèi)的肥大細(xì)胞數(shù)、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)隨接菌時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，各組間差異不顯著，均極顯著高于生理鹽水組(P<0.01)。在接菌后12～48h問(wèn)，低、高劑量治療組小鼠乳腺內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)總體上低于模型組，但差異不顯著。模型組乳腺組織TNF-α、IFN-γ接菌后極顯著

8、升高(P<0.01)，0.5mg/mL和1.0mg/mL鹽酸小檗堿均能顯著降低乳腺內(nèi)TNF-α和IFN-γ的含量，且呈劑量依賴性。接菌后24h治療組血清IFN-γ水平明顯降低：接菌后48h，高劑量治療組顯著低于模型組(P<0.05)，低、高劑量組與生理鹽水組相比差異不顯著。上述結(jié)果表明，鹽酸小檗堿可抑制乳腺內(nèi)金黃色葡萄球菌的增殖，減少PMN浸潤(rùn)，降低乳腺組織TNF-α、INF-γ水平，降低血清INF-γ水平并維持在一定范圍之內(nèi)，即參與機(jī)

9、體免疫反應(yīng)又抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，減輕炎癥介質(zhì)對(duì)乳腺的損傷，證實(shí)鹽酸小檗堿對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌性乳腺炎有保護(hù)作用。 結(jié)論：通過(guò)乳頭管將金黃色葡萄球菌注入小鼠乳腺建立實(shí)驗(yàn)性乳腺炎病理模型，接菌量以5.0x10<'2> CFU/50μL為宜；鹽酸小檗堿不僅在體外對(duì)乳腺炎患牛乳樣中分離的金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌和殺菌作用，而且能明顯抑制金黃色葡萄球菌在小鼠乳腺內(nèi)的增殖；鹽酸小檗堿可明顯減輕小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎的病理反應(yīng)，減輕乳腺