奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌FnbpA高免血清的制備和核酸疫苗的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎(cowmastitis)是制約奶牛業(yè)發(fā)展和危害消費(fèi)者健康的重要因素之一。國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料顯示,近年來各種類型的乳腺炎特別是隱性乳腺炎的發(fā)病數(shù)約占泌乳期奶?？倲?shù)1/3,而且發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。奶牛乳腺炎主要由大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引起,其中以金黃色葡萄球菌的危害較大。由于奶牛養(yǎng)殖業(yè)中抗生素長(zhǎng)期和盲目的使用及金黃色葡萄球菌本身很容易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn),其防治難度越來越大。金黃色葡萄球菌感染動(dòng)物,會(huì)吸附和定殖組織器官的細(xì)胞上。纖連

2、蛋白結(jié)合蛋白A(fibronectinbindingproteinA,FnbpA)和凝集素因子A(clumpingfactorA,ClfA)在金黃色葡萄球菌定殖過程中起到關(guān)鍵作用,其中FnbpA對(duì)組織中的纖連蛋白(fibronectin,Fn),纖維蛋白(fibrinogen,Fg)以及膠原纖維(elastin,En)等都具有吸附并結(jié)合的功能。本研究的目的就是著手于金黃色葡萄球菌對(duì)動(dòng)物的感染途徑中,阻止細(xì)菌對(duì)細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞的吸附作用,從

3、而達(dá)到預(yù)防細(xì)菌感染的目的。
　　本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的基因FnbpA序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模版利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FnbpA部分基因,連接到pMD-18TSimple載體并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明,獲得的FnbpA基因片段同國(guó)內(nèi)國(guó)際發(fā)表的基因同源性在77％-98%。同時(shí),以FnbpA的A區(qū)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物和PGEX-4T-2空載分別雙酶切,構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-Fn,轉(zhuǎn)化至B

4、L21大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GST凝膠純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果在66kD附近出現(xiàn)了清晰的目的蛋白條帶,與預(yù)期的分子量大小相一致,將純化的蛋白經(jīng)弗氏佐劑乳化對(duì)家兔進(jìn)行皮下注射免疫,制備高免血清,用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià),三免后血清檢測(cè)效價(jià)可達(dá)106.18。
　　以pVAX-1為真核表達(dá)載體,用延伸PCR方法在目的基因的5'端加入荷斯坦奶牛IFN-γ基因的信號(hào)肽序列構(gòu)建PV-SFn質(zhì)粒。構(gòu)建成功的質(zhì)粒

5、序列經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析和WesternBlot試驗(yàn)證實(shí),表達(dá)產(chǎn)物具有典型的信號(hào)肽序列且能夠成功的在BHK-21細(xì)胞中分泌表達(dá),抗原性沒有發(fā)生變化。
　　將去內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒100μg/只以殼聚糖為佐劑肌肉注射免疫體重25g左右健康C57小鼠,3周后進(jìn)行第二次免疫。同時(shí)設(shè)PBS和pVAX-1質(zhì)粒對(duì)照組。在每次免疫后一周采血進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)。二免后3個(gè)月采取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行MTT試驗(yàn),檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。同時(shí)對(duì)其他小鼠進(jìn)