轉(zhuǎn)ScMV-CP基因甘蔗抗病的分子基礎(chǔ)及環(huán)境安全性評價.pdf

1、甘蔗花葉病嚴重影響甘蔗生長，是甘蔗生產(chǎn)中主要病害之一。通過基因工程培育抗花葉病品種是甘蔗高效育種的輔助手段，2003年農(nóng)業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點實驗室通過基因槍介導將ScMV-CP基因轉(zhuǎn)入高感花葉病的甘蔗品種拔地拉(Badila)，獲得了13個轉(zhuǎn)ScMV-CP基因甘蔗無性系。本研究以轉(zhuǎn)CP基因甘蔗作為材料，研究轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗病穩(wěn)定性和工農(nóng)藝性狀表現(xiàn)；通過轉(zhuǎn)基因甘蔗的光合特性研究其增產(chǎn)的光合基礎(chǔ)；通過反復抗性鑒定，從中選擇抗病強轉(zhuǎn)基

2、因無性系進行人工接種研究其抗病的生理生化基礎(chǔ)和分子基礎(chǔ)；并對轉(zhuǎn)基因甘蔗環(huán)境安全性進行了初步評價；研究結(jié)果表明： 轉(zhuǎn)基因甘蔗明顯提高了抗甘蔗花葉病毒的能力，人工接種和自然誘發(fā)鑒定，花葉病發(fā)病率在0-34％之間，而且在不同世代保持穩(wěn)定的水平；而非轉(zhuǎn)基因甘蔗拔地拉(Badila)發(fā)病率達92-100％；通過工農(nóng)藝性狀和抗病性綜合考察，選出了5個轉(zhuǎn)基因甘蔗進入環(huán)境釋放，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因甘蔗發(fā)病率在0-20％之間，株高比非轉(zhuǎn)基因甘蔗增加2

3、3-32％，有效莖數(shù)增加45-55％，每公頃蔗莖產(chǎn)量增加62-80.6％，甘蔗糖分絕對值提高1.15-2.15％。在13個轉(zhuǎn)CP基因甘蔗中以轉(zhuǎn)基因甘蔗B48表現(xiàn)最為優(yōu)異，在多年的人工抗性鑒定和自然誘發(fā)鑒定均未發(fā)病，綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異。 通過轉(zhuǎn)基因甘蔗B48與非轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片細胞超微結(jié)構(gòu)、葉綠體蛋白質(zhì)組及葉片光合特性的比較，結(jié)果表明：非轉(zhuǎn)基因甘蔗的葉片細胞超微結(jié)構(gòu)呈典型的甘蔗花葉病毒侵染后的病理特征；葉片中細胞葉綠體被破壞，基粒

4、片層消失；通過葉綠體蛋白的雙向電泳進一步發(fā)現(xiàn)，非基因甘蔗葉綠體光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ中光系統(tǒng)Ⅰ蛋白、放氧復合體(OEC)蛋白下調(diào)，說明病毒侵染對非轉(zhuǎn)基因甘蔗葉綠體的光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ造成損傷，從而使非轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片的CO<,2>同化能力下降；而轉(zhuǎn)基因甘蔗的葉片細胞保持完整，細胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病毒粒子，葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，光系統(tǒng)保持正常，葉綠素含量高，PEPC酶活性強，從而使轉(zhuǎn)基因甘蔗保持較高光合作用能力。 接種甘蔗花葉病毒后，轉(zhuǎn)基因甘蔗接種后

5、游離．SA增加的量比原種大，時間提前，同時SOD、POD活性提高，CAT活性顯著降低，這有利于增加體內(nèi)H<,2>O<,2>的積累，加強了細胞壁的氧化交聯(lián)，限制了病毒進一步侵染；而非轉(zhuǎn)基因甘蔗SOD、POD活性提高緩慢，下降快，CAT活性下降慢，影響了H<,2>O<,2>的積累，無法及時有效地建立抗病信號的傳導途徑來誘導抗性基因的表達。苯丙烷代謝研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因甘蔗在接種后葉片PAL活性迅速上升，并保持相對較高的水平；而轉(zhuǎn)基因甘蔗PA

6、L活性上升要滯后于轉(zhuǎn)基因甘蔗，而且下降迅速。非轉(zhuǎn)基因甘蔗PPO活性上升比轉(zhuǎn)基因甘蔗慢而且增加的幅度也?。晦D(zhuǎn)基因甘蔗接種后積累類黃酮速度快，持續(xù)時間長，含量增幅較大，在整個過程中保持一個相對較高的濃度，非轉(zhuǎn)基因接種后類黃酮含量下降而且變動幅度大。 利用本實驗室開發(fā)的斑茅(甘蔗的近緣屬植物)干旱脅迫下的cDNA微陣列，研究了轉(zhuǎn)基因甘蔗B48和非轉(zhuǎn)基因甘蔗接種后基因表達的差異情況，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)因甘蔗接種后上調(diào)表達的克隆有43個，主要參

7、與細胞的結(jié)構(gòu)保護、信號傳導、蛋白質(zhì)合成、能量代謝、呼吸作用等有關(guān)過程；這說明接種病毒激活了轉(zhuǎn)基因甘蔗體內(nèi)眾多抗病基因。利用芯片雜交的結(jié)果，克隆了候選MYB基因的片段，生物信息學分析該MYB基因?qū)儆诘湫蚏2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子，實時定量PCR分析表明所克隆的甘蔗MYB基因在不同組織表達特異性不明顯，但是受外源SA和H<,2>O<,2>強烈誘導。 接種后的葉片蛋白質(zhì)組研究表明：轉(zhuǎn)基因甘蔗與非轉(zhuǎn)基因甘蔗的葉片蛋白的2-DE圖譜有明顯差

8、異，在轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片中有10個蛋白表達上調(diào)，1個蛋白特異誘導表達；而非轉(zhuǎn)基因甘蔗中3個表達上調(diào)，1個特異誘導。質(zhì)譜鑒定表明，轉(zhuǎn)基因甘蔗中核因子激酶、細胞質(zhì)APX和Mn-SOD被誘導上調(diào)表達；而在非轉(zhuǎn)基因甘蔗中鐵氧還蛋白和甘蔗旱誘導蛋白表達上調(diào)。 轉(zhuǎn)基因甘蔗環(huán)境安全性評價結(jié)果表明：田間轉(zhuǎn)基因甘蔗與非轉(zhuǎn)基因甘蔗害蟲的危害沒有差異，在土壤總DNA未檢測到外源ScMV-CP基因；轉(zhuǎn)基因甘蔗根際土壤的細菌和真菌數(shù)量明顯提高，但放線菌數(shù)量差

9、異不明顯；轉(zhuǎn)基因甘蔗中的NPTⅡ標記基因并沒有增加對卡那霉素抗性的土壤微生物數(shù)量；轉(zhuǎn)基因甘蔗和非轉(zhuǎn)基因甘蔗根際細菌多樣性研究表明，Simpson指數(shù)(D’)、Shannon-Wiener指數(shù)(H’)、Mclntosh指數(shù)(DMc)差異不明顯，說明轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤細菌的多樣性影響很??；轉(zhuǎn)基因甘蔗顯著提高了根際土壤脲酶活性，但對土壤的蔗糖酶和磷酸單脂酶沒有影響。初步研究表明，轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤細菌和真菌有一定的影響，但對放線菌影響很??；就目前