番木瓜環(huán)斑病毒CP基因IR表達載體的轉化及抗病性研究.pdf

1、生產(chǎn)上番木瓜普遍受到病毒侵害的困擾，其中番木瓜環(huán)斑病毒造成的危害由來已久。而抗番木瓜環(huán)斑病毒的番木瓜育種工作又遇到重重障礙，這些障礙包括缺乏對PRSV具有抗性的栽培品種，PRSV株系在不同地區(qū)有差別以及存在遠緣雜交不親和現(xiàn)象。
　　 植物基因工程的發(fā)展為番木瓜抗PRSV提供了一條新的途徑。近幾年關于RNAi的研究眾多，其中的一大熱點就是用植物病毒本身的一段基因合成反向重復表達載體轉化植物以使其獲得遺傳穩(wěn)定的抗病性，這在很大程度上

2、解決了運用傳統(tǒng)方法選育抗病株系的困難。
　　 本研究以番木瓜環(huán)斑病毒的寄主植物番木瓜和黃瓜為實驗材料，利用農(nóng)桿菌介導法和PEG介導法將外殼蛋白CP基因反向重復表達載體導入受體材料中，并分析轉入基因對植物的抗病性的影響，主要研究結果如下：
　　 (1)利用番木瓜的不同部位用不同的培養(yǎng)基誘導胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)番木瓜的莖段和幼胚能在C3培養(yǎng)基上誘導出胚性愈傷組織，并誘導長出胚狀體。后者比前者所需時間更短。本實驗中還發(fā)現(xiàn)胚狀體還

3、能作為二次誘導胚狀體的材料，且需時更少。
　　 在用農(nóng)桿菌介導的方法對誘導得到的胚狀體進行轉化的過程中，由于農(nóng)桿菌的污染問題未能有效解決，而少數(shù)未污染的胚狀體在篩選培養(yǎng)基上逐漸褐化，未能得到轉化苗。
　　 (2)先利用黃瓜“津研4號”的不同部位作為外植體，用不同的培養(yǎng)基進行不定芽的誘導。發(fā)現(xiàn)當用黃瓜的子葉節(jié)作為外植體在培養(yǎng)基MS+1.5mg/L6-BA+2.0mg/LAgNO3上能誘導出狀態(tài)良好的不定芽，不定芽在1/2M

4、S培養(yǎng)基中能伸長生根。
　　 利用該黃瓜再生體系，用農(nóng)桿菌介導法用不同的方法將含外殼蛋白CP基因反向重復表達載體pWatergate-CP861IR，pHellsgate12-CP2i5IR轉化受體材料，得到11株Kan抗性苗。經(jīng)PCR檢測，其中1株確認為pWatergate-CP861IR轉化苗，3株為pHellsgate12-CP215IR轉化苗，陽性率為36.4％。而且發(fā)現(xiàn)這4株轉化苗都是在農(nóng)桿菌侵染時用超聲波處理了2～3

5、s的子葉節(jié)誘導得到的，其他方法都未能得到轉化苗，說明在農(nóng)桿菌侵染時用超聲波處理能夠提高轉化率。對得到的黃瓜轉化苗進行煉苗處理，并移栽到蛭石中，黃瓜轉化苗未能成活。
　　 (3)利用PRSV病葉提取PRSV粒子，提取得到的病毒濃度為1.0875mg/L。用番木瓜實生苗的葉片制備原生質體，并用PEG介導法將pHellsgate12-CP861IR基因和PRSV粒子共轉化番木瓜原生質體。提取原生質體RNA，通過RT-PCR檢測pHel

6、lsgate12-CP861IR基因對PRSV的沉默抑制效果。
　　 結果顯示，該番木瓜品種為CP基因轉化品種，當加入的PRSV量為0.2μg，2μg時，未能檢測到PRSV的CP基因，當PRSV的量為20μg時，能檢測到PRSV的CP基因。當10μg pHellsgate12-CP861IR基因和0.2μg，2ug或20μg PRSV粒子共轉化原生質體時，檢測不到CP基因，說明pHellsgate12-CP861IR基因的加入啟