中藥止瀉液對(duì)鼠輪狀病毒腸炎腸道水通道蛋白影響的研究.pdf

1、目的: 1.輪狀病毒性腸炎動(dòng)物模型的建立； 2.輪狀病毒性腸炎腸道水通道蛋白的改變； 3.中藥止瀉液對(duì)輪狀病毒性腸炎腸道水通道蛋白的影響。 材料與方法: 1.研究對(duì)象:清潔級(jí)昆明種乳鼠，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2.輪狀病毒:人輪狀病毒于2007年11月取自廣州市兒童醫(yī)院門(mén)診診斷為輪狀病毒感染患兒的糞便。猴輪狀病毒（SA11株）由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)研究所饋贈(zèng)。 3.輪狀病毒

2、性腸炎動(dòng)物模型的建立:腹瀉組（B組）每只乳鼠分別用150ul含1×104TCID50輪狀病毒液灌胃；空白組（A組）用凍融離心后的不含輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物150ul向乳鼠灌胃。 4.中藥止瀉液干預(yù)模型的建立:C，D組乳鼠分別于接種輪狀病毒后第24小時(shí)，第48小時(shí)給予灌注止瀉液（1.86g/ml），每日三次，每次50ul。 5.取材:分離乳鼠腸段（空腸，回腸，結(jié)腸），標(biāo)記后置于液氮保存。 6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)腸道

3、水通道蛋白的mRNA作定性與相對(duì)定量，由于mRNA經(jīng)過(guò)表達(dá)后成為蛋白質(zhì)，兩者成正比關(guān)系，所以可以通過(guò)mRNA推測(cè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與數(shù)量。 1）腸道組織總RNA的提取； 2）對(duì)總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)； 3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸道水通道蛋白1，3，4，8mRNA。 7.結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。 結(jié)果： 1.輪狀病毒性腸炎動(dòng)物模型 乳鼠感染SA11株第2天后出現(xiàn)明顯的臨床腹瀉癥

4、狀，至少在感染后連續(xù)6天動(dòng)物大便中可檢測(cè)到較高滴度的輪狀病毒（RV）抗原；乳鼠感染人輪狀病毒后，連續(xù)觀察6天均未出現(xiàn)腹瀉癥狀，動(dòng)物大便中亦未檢測(cè)到RV抗原。 2.中藥止瀉液干預(yù)模型 干預(yù)組（C組）乳鼠在接種病毒液后48h，其中4只乳鼠出現(xiàn)明顯的RV感染癥狀，主要表現(xiàn)為腹瀉（淡黃色水樣便），腹瀉率為33％，喂毒后第3，4天，4只腹瀉乳鼠臨床癥狀減輕，表現(xiàn)為排黃色糊狀便，腸外癥狀不明顯。接毒后第5至7天，乳鼠均無(wú)腹瀉，排黃色

5、成形便。 干預(yù)組（D組）乳鼠在接種病毒液后48h，10只乳鼠均出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀（淡黃色水樣便），腹瀉率為100％，接毒后72h，乳鼠腹瀉程度減輕，接毒后第4，5天乳鼠排黃色糊狀便，接毒后第6，7天，乳鼠無(wú)腹瀉，排黃色成形便。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 1）空白組乳鼠空腸，回腸和近端結(jié)腸腸道黏膜均有水通道蛋白1，3，4，8mRNA的表達(dá)； 2）空腸AQP8mRNA在腹瀉組乳鼠中表達(dá)量顯著高于空白組；

6、 3）回腸AQP1mRNA在腹瀉組中表達(dá)顯著低于空白組； 4）在空腸，回腸中，腹瀉組與空白組其余水通道蛋白mRNA表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 5）結(jié)腸，腹瀉組與空白組AQP1，3，4，8mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 6）C與D組空腸組織中，4種水通道蛋白mRNA表達(dá)量與空白組無(wú)明顯差異； 7）C與D組回腸組織中，4種水通道蛋白mRNA表達(dá)量與空白組無(wú)明顯差異； 8）C與D組結(jié)腸組織中，AQP1mRNA表

7、達(dá)明顯比空白組上升，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余AQP3，4，8mRNA表達(dá)量C，D組與空白組無(wú)明顯差異。 結(jié)論： 1.昆明乳鼠對(duì)SA11株易感，對(duì)人輪狀病毒不易感。 2.腹瀉組乳鼠空腸AQPSmRNA表達(dá)上升，提示AQP8參與腸道水的吸收與分泌，代償性表達(dá)增加，可以減輕乳鼠腹瀉癥狀。 3.腹瀉組乳鼠回腸AQP1mRNA表達(dá)下降，提示隨著AQP1減少，回腸吸收功能障礙，水吸收量減少，導(dǎo)致糞便稀薄形成水樣便。

8、 4. AQP8mRNA表達(dá)量增加不及AQP1mRNA表達(dá)量減少的程度，使腹瀉組乳鼠仍以水樣便為主要表現(xiàn)。 5.輪狀病毒腸炎的致瀉機(jī)制可能與近端結(jié)腸AQP1，3，4，8無(wú)關(guān)。 6.中藥干預(yù)組（C，D組）乳鼠結(jié)腸AQP1mRNA表達(dá)上升，提示中藥液能明顯提高乳鼠結(jié)腸組織AQP1mRNA的表達(dá)，可能通過(guò)增加結(jié)腸對(duì)水分的吸收，來(lái)達(dá)到收斂止瀉的作用。 7.在本研究中，中藥液對(duì)輪狀病毒腸炎乳鼠腸道AQP3，4，8沒(méi)