AGEs對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響及二甲雙胍干預(yù)作用的研究.pdf

1、[背景]
　　 結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率在全部惡性腫瘤中居第四位。近年來(lái),隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的提高,結(jié)直腸癌的發(fā)病率也在迅速增長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外的大量流行病學(xué)研究表明,糖尿病患者結(jié)直腸癌的發(fā)生率和死亡率較非糖尿病患者顯著增加。因此,糖尿病與結(jié)直腸癌的關(guān)系及其機(jī)制越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。
　　 目前,糖尿病患者高發(fā)結(jié)直腸癌的因?yàn)楹蜋C(jī)制尚不十分清楚,一般認(rèn)為與高血糖、胰島素抵抗和(或)高胰島素血

2、癥等因素有關(guān)。近年來(lái)的研究顯示晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能也是糖尿病患者高發(fā)結(jié)直腸癌的重要發(fā)病機(jī)制之一。早在1993年,IKI等研究發(fā)現(xiàn)AGEs可以誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子IL-6的產(chǎn)生促進(jìn)腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng),并認(rèn)為AGEs可能是糖尿病患者高發(fā)腎細(xì)胞癌的重要因?yàn)楹桶l(fā)病機(jī)制。Abe等研究亦發(fā)現(xiàn)AGEs可以促進(jìn)人黑色素瘤細(xì)胞株G361和A375的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

3、,并將黑色素瘤接種到裸鼠,發(fā)現(xiàn)黑色素瘤區(qū)AGEs的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚,而用AGEs受體拮抗劑可以抑制其生長(zhǎng)并阻斷其向肺部轉(zhuǎn)移,能夠延長(zhǎng)裸鼠的生存期。
　　 近年來(lái),糖尿病的治療與惡性腫瘤的關(guān)系受到內(nèi)分泌界的廣泛關(guān)注。最近的流行病學(xué)研究表明,二甲雙胍作為一種胰島素增敏劑除了能降低血糖外,還具有抑制腫瘤的作用,能降低糖尿病患者的腫瘤風(fēng)險(xiǎn),因此受到越來(lái)越多學(xué)者們的關(guān)注。
　　 二甲雙胍是2型糖尿病的一線用藥,主要是通過(guò)A

4、MPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制肝糖產(chǎn)生和輸出,促進(jìn)外周組織攝取利用葡萄糖,抑制脂肪分解,減輕胰島素抵抗來(lái)降低血糖。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是組織細(xì)胞中重要的能量代謝調(diào)節(jié)通路之一,對(duì)于維持組織細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP的比例,調(diào)控蛋白與脂肪的合成與分解,以及細(xì)胞的應(yīng)激均有重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)AMPK信號(hào)通路還參與了對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程的調(diào)控。現(xiàn)已證實(shí),當(dāng)AMPK處于磷

5、酸化激活狀態(tài)時(shí),可以引起細(xì)胞內(nèi)p53-p21途徑的激活,進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程；同時(shí),活化的AMPK還可以通過(guò)抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,二甲雙胍除了具有降糖的作用外,可能通過(guò)AMPK信號(hào)通路發(fā)揮抗癌作用。目前,二甲雙胍抑制腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明,因此有必要作進(jìn)一步的研究。
　　 目前,AGEs及二甲雙胍在結(jié)腸癌細(xì)胞上的研究較少。因此,本研究將以人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480為模型,探討AGEs和二甲雙胍對(duì)S

6、W-480細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制,并進(jìn)一步評(píng)估二甲雙胍的干預(yù)作用對(duì)AGEs在SW-480細(xì)胞上的作用的影響。
　　 本研究包括以下三部分:
　　 第一章AGEs對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響及其機(jī)制的研究
　　 [目的]探討AGEs對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480增殖的影響及其作用機(jī)制。
　　 [研究對(duì)象和方法]
　　 1.以人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象:SW-480細(xì)胞培養(yǎng)于37℃

7、、5％CO2、含10％胎牛血清、1％青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中,隔天傳代1次。
　　 2.體外制備AGE修飾牛血清白蛋白(AGE-BSA.)和BSA:將BSA與PBS混合后于37℃孵育60天,4℃透析24h以去除未結(jié)合的葡萄糖。體外制備的AGE-BSA經(jīng)熒光分光光度計(jì)鑒定,AGEs含量為102.67U/mg蛋白,BSA對(duì)照為12.84U/mg。
　　 3.MTT測(cè)細(xì)胞活力:取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞,接

8、種至96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)液100ul/孔。細(xì)胞貼壁后以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,設(shè)置空白對(duì)照組,BSAX寸照組和AGE組(分3組,AGE-BSA終濃度分別為50、100、500ug/ml),每組4復(fù)孔,加入相應(yīng)培養(yǎng)液,72h后加MTT孵育4h,然后去上清,加DMSO振蕩10分鐘后酶標(biāo)儀上測(cè)各孔490nm處吸光值(OD值)。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期:收取BSA對(duì)照組及100ug/mlAGE組干預(yù)72h后的細(xì)胞,PBS洗兩遍

9、,予預(yù)冷的70％酒精4℃固定過(guò)夜,用PBS洗兩遍,離心棄PBS,加入PI染液(碘化丙啶及RNasc A終濃度均為50ug/ml)避光染色30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)行細(xì)胞周期分析,比較G0/G1,S期和G2/M期的差異。
　　 5.Western blotting測(cè)定CyclinD1的表達(dá):收取BSA對(duì)照組及100 ug/mlAGE組干預(yù)72h后的細(xì)胞。進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞裂解獲取蛋白后,與預(yù)染蛋白marker一起上樣,經(jīng)濃縮膠和分離

10、膠進(jìn)行SDS-PAGE電離,完畢后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,將膜放入含50g/L脫脂奶粉的TBST中常溫封閉2h,然后與一抗(CyclinD1一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)按1:250的比例4℃孵育過(guò)夜,用TBST液洗膜3次,每次5min,PVDF膜再分別與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗(1:5000)室溫孵育1h后,用TBST液洗膜3次,每次5 min。用ECL顯色試劑盒顯示目的條帶,掃描后用Quantity One軟件分析

11、條帶。
　　 6.用TRAP銀染法測(cè)定AGEs對(duì)端粒酶活性的影響:根據(jù)端粒酶活性試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)提取BSA對(duì)照組及100ug/mlAGE組干預(yù)72h后的端粒酶。吸取5μL10xTRAP buffer,另加入1μL dNTPs,1μL Taq-DNA polymerase,1μL TSprimer,2μL端粒酶提取物,然后加入39μL滅菌超純水,于PCR增儀上23℃保溫30min,加入1μL CX primer,混勻,在擴(kuò)增儀上進(jìn)

12、行36個(gè)循環(huán),循環(huán)參數(shù)94℃,30s:50℃,30s；72℃,90s；最后72℃延伸10min。取9ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加上1ul上樣緩沖液混勻后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部為止,取出凝膠進(jìn)行銀染。拍照后用Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析。
　　 7.數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),若方差不齊采用Wel

13、ch近似方差分析；多重比較采用LSD法(Least-significant difference tea),如果方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。兩組數(shù)據(jù)間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05(雙側(cè))為差異有顯著性。
　　 [結(jié)論]
　　 1.AGEs可以促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的增殖,呈劑量依賴(lài)性。
　　 2.AGEs促進(jìn)SW-480細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能與其上調(diào)CyclinDl的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周

14、期紊亂和增加端粒酶活性有關(guān)。
　　 第二章 二甲雙胍對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響及其機(jī)制的研究
　　 [目的]
　　 探討二甲雙胍對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖的影響及其作用機(jī)制。
　　 [研究對(duì)象和方法]
　　 1.以SW-480為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,培養(yǎng)方法同前；
　　 2.以PBS溶解鹽酸二甲雙胍粉末,對(duì)照組加入同等量的PBS；
　　 3.MTT實(shí)驗(yàn)分為PBS組,1、5、10m

15、mol/L二甲雙胍組；其余實(shí)驗(yàn)分為PBS組和5mmol/L二甲雙胍組(MET組)。
　　 4.MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,細(xì)胞周期檢測(cè),CyclinDl的檢測(cè),端粒酶活性檢測(cè)方法同第一章；
　　 5.數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組數(shù)據(jù)間的比較采用One-way ANOVA,若方差不齊采用Welck近似方差分析；多重比較采用LSD法,如果方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。兩組數(shù)據(jù)間

16、的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05(雙側(cè))為差異有顯著性。
　　 [結(jié)論]
　　 1.二甲雙胍可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的增殖,呈時(shí)間劑量依賴(lài)性。
　　 2.二甲雙胍抑制SW-480細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能與其下調(diào)CyclinD1的表達(dá)使細(xì)胞周期G0/G1期阻滯和抑制端粒酶活性有關(guān)。
　　 第三章 二甲雙胍對(duì)AGEs誘導(dǎo)的SW-480細(xì)胞增殖作用的影響及其機(jī)制的研究
　　 [目的]

17、>　　 探討二甲雙胍對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480增殖作用的影響及其作用機(jī)制。
　　 [研究對(duì)象和方法]
　　 1.以SW-480為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,培養(yǎng)方法同前；
　　 2.AGE-BSA、BSA制備及二甲雙胍(MET)配制同前。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分為三組,BSA組,100ug/ml AGE組,及100ug/ml AGE+5mmol/L MET組(A+M組),每組同時(shí)干預(yù)72d小時(shí)；
　　 4

18、.MTT檢測(cè)細(xì)胞活力,細(xì)胞周期檢測(cè),CyclinDl的檢測(cè),端粒酶活性檢測(cè)方法同第一章；
　　 5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,各組內(nèi)均數(shù)比較采用One-wayANOVA,若方差不齊采用Welch近似方差分析:多重比較采用LSD法,如果方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1.二甲雙胍可以抑制AGEs所誘導(dǎo)的促人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480