FHIT基因對SW480人結腸癌細胞生長增殖影響的實驗研究.pdf

1、背景:近年來結腸癌發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。手術仍是治療的關鍵手段，而術后放、化療對提高生存率作用有限。因此，尋求新的結腸癌早期診斷和治療的方法對于提高其手術切除率和生存率，改善生活質量具有重要的意義。隨著腫瘤免疫學和分子生物學研究的進展，結腸癌發(fā)生發(fā)展和轉移的分子機制已經(jīng)部份闡明，為結腸癌的基因治療提供了理論基礎。本課題組的前期研究證明脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）基因表達缺失在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，但目前其應用于基因治

2、療總的效果仍不理想，許多還處于臨床前實驗階段，加上人體基因表達機制十分復雜，到目前為止有些環(huán)節(jié)還不清楚，需要繼續(xù)深入研究，以便更好地發(fā)揮基因治療的作用。外源性FHIT基因轉染入FHIT基因表達缺失的結腸癌中誘導癌細胞凋亡的分子機制一旦明確，將為結腸癌的治療提供全新的分子治療策略。本研究擬通過陽離子脂質體Lipofectamine2000的介導下將基因工程技術構建的真核表達載體pFHIT轉染入人結腸癌細胞系SW480中，通過G418篩選、

3、濾紙片法結合有限稀釋法挑選單克隆穩(wěn)定轉染株，檢測SW480-FHIT、轉染空質粒pRc/CMV2的SW480-NEO細胞株以及野生型SW480細胞系的FHIT表達情況；觀察FHIT在體外對細胞生長增殖及細胞周期和凋亡的影響；建立BALB/C NU裸鼠SW480皮下結腸癌模型，探討FHIT在體內抗腫瘤效應。 第一部分構建穩(wěn)定表達FHIT的SW480結腸癌細胞株 一．目的:構建穩(wěn)定表達FHIT的SW480結腸癌細胞株。

4、 二．方法 1．細胞培養(yǎng):SW480細胞復蘇后以含10%胎牛血清、高糖DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2．真核表達載體的轉染、G418篩選及挑選單克隆穩(wěn)定轉染株:以陽離子脂質體Lipofectamine2000介導將FHIT表達載體質粒pFHIT和空載體質粒pRc/CMV2轉染人結腸癌細胞株SW480。轉染48小時后，采用梯度漸增法確定的含G418完全DMEM培養(yǎng)基對轉染細胞進行篩選。維持最適篩選濃度14天后用濾紙消

5、化法結合有限稀釋法挑選并擴增單克隆細胞株。 3．RT-PCR及Western Blot檢測各組細胞FHIT表達的檢測:Trizol法提取細胞總RNA，樣品進行紫外分光光度儀檢測及1%瓊脂糖膠電泳檢測判斷產(chǎn)量及質量。RT-PCR檢測FHIT表達。PLC蛋白裂解液裂解細胞后提取總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉膜后孵育1抗、2抗，ECL發(fā)光法檢測目的FHIT蛋白表達。 三．結果 1．重組質粒的鑒定結果:分別以FHIT

6、重組質粒以及pRc/CMV2質粒為模板，加入FHIT引物構建PCR體系進行特異性擴增，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見FHIT為模板組出現(xiàn)431bp的條帶，而pRc/CMV2則無相應條帶。 2．真核載體轉染、G418篩選、有限稀釋法挑選單克隆穩(wěn)定轉染株結果使用Lipofectamine2000陽離子脂質體進行真核細胞載體的轉染對細胞的損傷較小，轉染效果滿意。對SW480細胞系來說，含800μg/ml G418的完全DMEM培養(yǎng)基

7、為最佳篩選濃度，400μg/ml為合理維持濃度。從轉染成功并通過篩選的細胞中通過濾紙消化法和有限稀釋法挑選單克隆并建立穩(wěn)定表達細胞株。 3．穩(wěn)定轉染株FHIT表達評價:分別以FHIT重組質粒以及pRc/CMV2質粒和空白SW480細胞株cDNA為模板，進行RT-PCR，轉染FHIT重組質粒的實驗組樣品可擴增出FHIT產(chǎn)物條帶，空白對照組、陰性對照組樣品均未擴增出FHIT產(chǎn)物條帶。而相應的Western blot檢測轉染FHIT的

8、細胞中有FHIT蛋白表達，而轉染空載體的細胞株和陰性對照均無目的條帶出現(xiàn)。三組均可擴增出內參GAPDH條帶。 四．結論：使用Lipofectamine2000陽離子脂質體進行真核細胞載體的轉染可以得到滿意的轉染效果。通過G418篩選、濾紙法結合有限稀釋法挑選單克隆，可以建立FHIT重組質粒穩(wěn)定轉染的人結腸癌細胞株。轉染了pFHIT的人結腸癌SW480細胞株可以穩(wěn)定表達FHIT，轉染空質粒pRc/CMV2及未轉染質粒的SW480野

9、生型細胞均不表達FHIT。 第二部分FHIT對SW480人結腸癌細胞生長增殖影響的體外實驗 一.目的：通過MTT法檢測細胞增殖能力、流式細胞儀分析細胞周期和凋亡改變，進而分析FHIT基因轉染對SW480人結腸癌細胞生長增殖的影響。 二．方法 1．分組：挑選穩(wěn)定表達FHIT的轉染株（設定為SW480-FHIT）進行以下實驗；挑選不表達FHIT的pRc/CMV2轉染株（設定為SW480-NEO）為陰性對照組；

10、以未轉染的SW480為空白對照組。 2．觀察細胞形態(tài):使用光學顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)。 3．MTT檢測細胞增殖能力:將上述三組細胞以每孔1×104個細胞量接種到96孔板，每組設置4個復孔，接種細胞后于不同的時間點采用MTT法檢測細胞增殖能力改變，并繪制細胞生長曲線。 4．流式細胞儀分析細胞周期和凋亡:于6孔板內接種上述三組細胞，待細胞長至90%匯合度時，胰酶消化法收取細胞，調整細胞密度為1×106/ml，PI染色

11、，以流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡變化，每組重復3次。 三．結果 1．細胞生長情況:正常營養(yǎng)、同等培養(yǎng)條件下，3組細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)觀察顯示無明顯差異。 2、噻唑藍比色法（MTT）檢測轉染前后細胞增殖能力的變化:空載體轉染細胞SW480-Neo和親本細胞SW480增殖無顯著差異，相比之下，F(xiàn)HIT基因轉染的細胞株SW480-FHIT較上述兩組細胞生長速度明顯減慢，尤其是達到對數(shù)生長期后更加明顯，差異顯著。

12、 3、SW480細胞轉染FHIT前后細胞周期和凋亡比率的變化：SW480-Neo和SW480細胞的細胞周期和凋亡比率檢測均未見顯著差異，而SW480-FHIT細胞和上述兩組細胞對比，G2/M期和S期比例顯著下降，而G0/G1期的細胞比例顯著增加，且凋亡率高于較其它兩組。 四．結論：FHIT基因可以降低人結腸癌細胞SW480的增殖能力，抑制其細胞周期并增加細胞的凋亡率。 第三部分FHIT對SW480人結腸癌細胞生長增殖影響

13、的體內實驗 一、目的：FHIT基因轉染對SW480人結腸癌細胞在裸鼠體內的生長增殖影響，并對其機制進行初步探討。 二、方法 1．實驗動物分組:60只SPF級4～5周齡雄性BALB/C NU裸鼠，隨機分為三組，每組20只，實驗組接種SW480-FHIT，陰性對照組接種SW480-NEO，空白對照組接種SW480。 2．動物模型的建立:常規(guī)培養(yǎng)細胞數(shù)量足夠并生長至對數(shù)期時，收集細胞鏡下計數(shù)，PBS重懸細胞制備

14、單細胞懸液，使活細胞濃度為5×107/ml。每只BALB/C NU裸鼠以0．2ml（即1×107個細胞）接種于右側背部皮下。 3．實驗觀察:觀察腫瘤形成情況；接種后第10天開始隔2天測量腫瘤體積，并繪制各組腫瘤生長曲線。腫瘤體積（mm3）以公式0．5×a×b2計算，a（mm）為腫瘤長徑，b（mm）為腫瘤短徑；待腫瘤體積至500mm3左右時每組隨機選取10只小鼠處死用于檢測，其余10只繼續(xù)培養(yǎng)，記錄生存時間，比較三組荷瘤小鼠的生存

15、期。 4．腫瘤標本檢測內容 （1）RT-PCR和Western Blot檢測腫瘤組織中FHIT表達。 （2）免疫組化檢測腫瘤組織FHIT、P53基因表達。 三、結果 1．FHIT對BALB/C NU裸鼠移植瘤生長的影響:在接種后7～10天，三組BALB/C NU裸鼠均可于皮下觸及腫瘤。腫瘤生長曲線可見SW480-FHIT組的腫瘤生長比SW480組和SW480-NEO組的腫瘤生長明顯為慢，對各時間點

16、的腫瘤體積進行單因素方差分析，比較組間差異有統(tǒng)計學意義。而兩對照組間的差異沒有統(tǒng)計學意義。 2．FHIT對BALB/C NU荷瘤裸鼠生存期的影響:SW480組的中位生存期為35天，950CI（30．868，39．132）； SW480-NEO組為37天，95%CI（35．482，38．518）； SW480-FHIT為48天，95%CI（43．868，52．132），三組的平均生存期分別為34．600±1．558、36．100±

17、1．479、50．700±3．685天。Log Rank法分析組間差異，見兩對照組間生存期差異無統(tǒng)計學意義，而實驗組分別與兩對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義。 3．腫瘤組織FHIT基因的表達情況:RT-PCR檢測結果提示SW480-FHIT組小鼠腫瘤組織中均有不同程度的FHIT基因表達，而Western Blot則表明FHIT蛋白有表達；相比之下，其它各組小鼠mRNA和蛋白水平均未檢測到FHIT表達。免疫組化結果顯示，SW480-