胰高血糖素樣肽-1在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦血管病中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦血管疾病是目前人類疾病中僅次于心臟病和腫瘤的第三大死亡原因。其中缺血性腦血管病約占全部腦卒中的60％～80％。溶栓治療是目前治療缺血性腦卒中較為成功的方法。但是由于溶栓治療時(shí)間窗狹窄和其嚴(yán)格的適應(yīng)癥及可能的嚴(yán)重副反應(yīng)等限制，僅1％左右的腦卒中患者能夠接受溶栓治療，并且溶栓治療的康復(fù)率只有30-35％。因此，廣大的科研和臨床工作者都在積極探索有效治療缺血性腦血管病的方法。
　　 近十余年隨著神經(jīng)影像學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，缺血

2、性腦損傷機(jī)制的研究已取得了巨大的進(jìn)步。缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，缺血后腦內(nèi)的免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等的相互作用在缺血性腦卒中的腦損傷過程中占有重要的地位。其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是疾病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。缺血性腦卒中理想的治療要求針對(duì)其病理生理機(jī)制，且有較長(zhǎng)的治療時(shí)間窗，副作用少，方便實(shí)施。
　　 伴隨干細(xì)胞技術(shù)和基礎(chǔ)研究的發(fā)展，細(xì)胞治療成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是卒中的最有前景的治療方法之一。干細(xì)胞移植治療可以通過修復(fù)

3、宿主神經(jīng)通路，誘導(dǎo)神經(jīng)重塑和新血管形成，分泌營(yíng)養(yǎng)因子，召集內(nèi)源性前體細(xì)胞等機(jī)制的共同作用促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。并且可靜脈輸注，方便實(shí)施。治療時(shí)間窗可為腦缺血后數(shù)小時(shí)到數(shù)周。近來臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)成為干細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞，因其不但具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，并且干細(xì)胞更原始，端粒更長(zhǎng)，活細(xì)胞數(shù)量更豐富，增殖能力更強(qiáng)，來源豐富，提取簡(jiǎn)單，不悖倫理，操作無創(chuàng)等一系列優(yōu)勢(shì)。
　　 但是目前基礎(chǔ)和臨床的干細(xì)胞移植研究結(jié)果

4、卻未能帶給人們預(yù)期的結(jié)果。其中可能的因素是體內(nèi)的局部病理環(huán)境限制了移植干細(xì)胞的存活和功能，如何提高移植細(xì)胞的存活和功能，成為目前人們關(guān)注的焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。干細(xì)胞移植治療要取得理想的效果，還應(yīng)根據(jù)患者的病理生理狀況，制定相應(yīng)的方案，使得進(jìn)入體內(nèi)的干細(xì)胞能夠達(dá)到足夠的數(shù)量，并能充分發(fā)揮其功能。針對(duì)缺血性腦血管病的病理生理機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——氧化應(yīng)激，減少其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的損傷，無疑是提高干細(xì)胞療效的一個(gè)可行方案。
　　 胰高血糖素樣肽

5、1（glucagon-likepeptide1，GLP-1）是營(yíng)養(yǎng)攝入后刺激腸道L細(xì)胞分泌的30個(gè)氨基酸殘基的肽類激素，由胰高血糖素原基因表達(dá)形成的腸促胰島素。GLP-1已經(jīng)成為治療2型糖尿病的新型藥物，應(yīng)用于臨床治療。GLP-1的基礎(chǔ)研究顯示GLP-1不僅對(duì)胰腺有重要的作用，可以促進(jìn)放大葡萄糖依賴的β細(xì)胞胰島素分泌，減少胰島素β細(xì)胞的凋亡，增加其新生，減少胰高血糖素的分泌，減慢胃排空，增加飽感，增加外周葡萄糖的清理。而且GLP-1在中

6、樞神經(jīng)系統(tǒng)也具有重要的生理作用:GLP-1可以通過血腦屏障，促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)和細(xì)胞存活，上調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)和酶的產(chǎn)生。GLP-1還被認(rèn)為是一種生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)有絲分裂，細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，并能打斷凋亡前過程。GLP-1通過與GLP-1R的結(jié)合發(fā)揮上述眾多的作用。有關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1可以防御氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)神經(jīng)元抵御氧化應(yīng)激損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。GLP-1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等都可以發(fā)揮抗氧化損傷的作用，一項(xiàng)采用大鼠大腦中動(dòng)

7、脈梗死模型的研究發(fā)現(xiàn)，Exending-4預(yù)處理與對(duì)照組相比可減少梗死體積的50％，并可提高短期的神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上有GLP-1受體表達(dá)，并且GLP-1可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，保護(hù)其維持未分化的作用，減少血清剝奪所誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
　　 關(guān)于GLP-1在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)和功能目前還尚未見報(bào)道，本課題旨在研究GLP-1是否可以協(xié)同增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦血管的作用，具體步驟是通

8、過臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)體系，進(jìn)一步研究:1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞上GLP-1受體的表達(dá);2GLP-1對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在氧化應(yīng)激損傷條件下的保護(hù)作用及可能機(jī)制;3GLP-1在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性卒中的可能機(jī)制，可否減少神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元新生和血管新生。各部分研究結(jié)果將簡(jiǎn)述如下:一、hUC-MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 采用直接組織塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs，通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞周期測(cè)定及流式

9、細(xì)胞儀分析其表面標(biāo)記(CD29，CD34，CD44，CD45，CD105，HLA-DR)和成骨、成脂肪誘導(dǎo)分化鑒定hUC-MSCs。結(jié)果顯示，hUC-MSCs呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞周期分析絕人多數(shù)處于G0/G1期，表面標(biāo)志檢測(cè)CD34和CD45、HLA-DR為陰性，CD29，CD44、和CD105均為陽性。成骨和成脂誘導(dǎo)可以使hUC-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨樣細(xì)胞和脂肪樣細(xì)胞，確定了所培養(yǎng)的細(xì)胞是高純度的符合干細(xì)胞特征的

10、hUC-MSCs。本部分實(shí)驗(yàn)建立了hUC-MSCs的穩(wěn)定培養(yǎng)體系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞來源。
　　 二、hUC-MSCs的GLP-1受體鑒定
　　 GLP-1受體的表達(dá)是GLP-1發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為陽性對(duì)照，人肝癌細(xì)胞株HepG2為陰性對(duì)照。通過RT-PCR方法鑒定人臍帶問充質(zhì)干細(xì)胞GLP-1受體的mRNA，用Westernblot檢測(cè)有無

11、GLP-1受體表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株HepG2為陰性對(duì)照，并進(jìn)行DAPI和FITC細(xì)胞免疫熒光雙染，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，RT-PCR可以檢測(cè)到GLP-1RmRNA表達(dá)，Westernblot可以檢測(cè)到GLP-1R表達(dá)，但略弱于HUVEC。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示為DAP1和FITC雙陽性。上述結(jié)果從mRNA和蛋白水平驗(yàn)證了hUC-MSCs表達(dá)GLP-1R，為后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 三、G

12、LP-1對(duì)hUC-MSCs氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 以正常培養(yǎng)基為對(duì)照組，以不同濃度過氧化氯（1OμMoI/L，20μMol/L,50μMol/L）作用hUC-MSCs2小時(shí)，以細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡率為檢測(cè)指標(biāo)，建立氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型。進(jìn)一步以不同濃度的GLP-1（1Onmol/L20nmol/L30nmol/L）作用于氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型，篩選出GLP-l的最佳作用濃度。為探討GLP-1的作用機(jī)制進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):

13、正常對(duì)照組，氧化應(yīng)激組，GLP-1處理組(20nmol/L)，Exending9-39+GLP-1處理組，P13K/Akt通路阻斷劑LY294002+GLP-1處理組。分別選用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡，CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，觀察各組的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活性。結(jié)果顯示過氧化氫對(duì)臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活性及凋亡的影響呈濃度依賴方式，以20μMol/L過氧化氫處理2小時(shí)為合適的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。20nmol

14、/1為GLP-1對(duì)抗過氧化氫損傷的最佳作用濃度。GLP-1的保護(hù)作用在添加Exending9-39（GLP-1的拮抗劑），LY294002（P13K/Akt通路阻斷劑）后消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:GLP-1對(duì)hUC-MSCs由過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷具有保護(hù)作用，是通過GLP-1與其受體結(jié)合，進(jìn)一步通過PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
　　 四、GLP-1聯(lián)合hUC-MSCs移植治療大鼠腦缺血模型的作用及機(jī)制初步研究
　　 建立

15、大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞模型，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組，大鼠中動(dòng)脈梗死組(MACO)，GLP-1治療組(缺血后給予腹腔注射90ng/100g)，hUC-MSCs移植治療組（缺血后48小時(shí)給予尾靜脈注射hUC-MSCslx106，1ml），hUC-MSCs+GLP-1聯(lián)合治療組（缺血后給予腹腔注射90ng/l00g，缺血后48小時(shí)給予尾靜脈注射UC-MSC1x106，1ml)。并按照時(shí)間分為1,3，7，14天四個(gè)亞組。分別在第7和第14天觀察一般狀況

16、（體重，血糖），各亞組進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分后處死。正常對(duì)照組取腦海馬部位免疫組化檢測(cè)GLP-1受體。同時(shí)分別用免疫組化檢測(cè)DCX觀察新生神經(jīng)元，檢測(cè)CD31，a-SMA觀察新生血管，c-fos檢測(cè)缺血灶周圍凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示:模型組大鼠血糖與其他各組比較有升高，考慮為腦梗塞引起的應(yīng)激有關(guān)。各組大鼠的體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組大鼠神經(jīng)功能均有改善，以聯(lián)合治療組顯著。C-fos免疫組化結(jié)果顯示GLP-1組神經(jīng)元凋亡顯著少于模型組，GLP