芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝研究.pdf

1、赤芍和白芍為我國常用中藥材。赤芍為毛莨科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch.）直接使用的干燥根，白芍為植物芍藥水煮去皮后使用的干燥根。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷是赤芍和白芍的兩種主要有效成分。本文采用體內(nèi)和體外研究方法分別對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷進(jìn)行了代謝研究。通過微生物轉(zhuǎn)化、腸內(nèi)菌溫孵、肝微粒體溫孵等技術(shù)研究二者的體外代謝，采用HPLC-MS/MS技術(shù)分析灌胃給藥后的

2、大鼠尿液、膽汁中的代謝物，初步探討了二者體外模型中的相互轉(zhuǎn)化以及體內(nèi)和體外研究結(jié)果的相關(guān)性。同時(shí)對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷與人、大鼠的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行了測定。本研究對明確芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷體內(nèi)過程進(jìn)而闡述白芍和赤芍藥材的體內(nèi)行為具有重要意義，為中藥的代謝研究做出了有價(jià)值的探索。
　　 第一部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷微生物轉(zhuǎn)化研究
　　 目的：研究芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的微生物轉(zhuǎn)化，分離鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
　　 方法：從18種真菌

3、中篩選出分別對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷有轉(zhuǎn)化能力的菌株，從中各選出1株轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化放大實(shí)驗(yàn)，分別采用硅膠、ODS填充柱色譜和制備高效液相色譜等技術(shù)分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，通過HPLC-MS和NMR技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的菌株分別是短刺小克銀漢霉AS3.970和總狀共頭霉.AS3.264。在短刺小克銀漢霉.AS3.970對芍藥苷的轉(zhuǎn)化液中分離得到了芍藥內(nèi)酯苷，在總狀共頭霉AS3.264

4、對芍藥內(nèi)酯苷的轉(zhuǎn)化液中分離得到了芍藥苷。
　　 結(jié)論：特定條件下，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷可以相互轉(zhuǎn)化。
　　 第二部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷腸內(nèi)菌代謝研究
　　 目的：通過離體實(shí)驗(yàn)研究大鼠腸內(nèi)菌對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝，體外制備代謝產(chǎn)物并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 方法：分別將芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷加至大鼠新鮮糞便中，于無氧條件下培養(yǎng)1、2、6、10、12、18、24、30、36 h時(shí)，吸取1 mL用等量的乙酸乙酯萃取

5、3次，渦旋混勻后取上層液氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)眉状既芙夂笕?0μL經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后用于HPLC-MS分析，并根據(jù)在各自最大吸收波長時(shí)積分所得峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線求得芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量，其他代謝物為相對含量。再分別取一定時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)化液經(jīng)高效液相色譜法制備與純化，回收有機(jī)溶劑后凍干分別得到芍藥苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M1和芍藥內(nèi)酯苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M2，采用核磁共振波譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)化曲線的結(jié)果表明，芍藥苷1 h后已經(jīng)開始轉(zhuǎn)化，

6、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M1的量不斷增大，到24 h達(dá)到轉(zhuǎn)化平衡，30 h時(shí)已經(jīng)開始轉(zhuǎn)化成其他代謝物；芍藥內(nèi)酯苷2 h時(shí)已經(jīng)開始發(fā)生化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物M2在30 h時(shí)達(dá)到平衡，后轉(zhuǎn)化為其他代謝物。HPLC-MS和NMR的分析表明芍藥苷可被大鼠腸內(nèi)菌代謝成芍藥內(nèi)酯苷，芍藥內(nèi)酯苷可被大鼠腸內(nèi)菌代謝成芍藥苷。
　　 結(jié)論：芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠腸內(nèi)菌群的作用下可以發(fā)生互相轉(zhuǎn)化。
　　 第三部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷肝微粒體代謝研究
　　 目的

7、：研究芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷經(jīng)肝微粒體溫孵后的代謝產(chǎn)物。
　　 方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法將芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別加入微粒體溫孵液中，溫孵一定時(shí)間后，處理并采用HPLC-DAD分析，確認(rèn)代謝物。
　　 結(jié)果：經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，在大、小鼠肝微粒體中均未發(fā)現(xiàn)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝物。
　　 結(jié)論：肝微粒體對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的代謝作用微弱。
　　 第四部分 HPLC-MS/MS初步分析大鼠尿液和膽汁中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯

8、苷的代謝物
　　 目的：分析推測芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠尿液和膽汁中的代謝產(chǎn)物。
　　 方法：分別灌胃給予雄性SD大鼠芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷藥液后，收集24 h內(nèi)的尿液，用等量乙酸乙酯萃取3次，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)眉状?00μL溶解，取樣用于HPLC-MS分析；膽管插管收集24 h內(nèi)膽汁，直接濃縮，0.45μm微孔濾膜過濾后，取樣用于HPLC-MS分析，分析推測代謝物。
　　 結(jié)果：在口服芍藥苷的大鼠尿中檢測到6種代謝產(chǎn)

9、物，推測其分別為單氧化、三氧化、單甲基化、雙甲基化、與水結(jié)合和葡萄糖苷酸化的產(chǎn)物。在口服芍藥內(nèi)酯苷的大鼠尿中檢測到7種代謝產(chǎn)物，推測其分別為去甲基化、雙氧化、與1分子葡萄糖結(jié)合和雙氧化、與1分子葡萄糖結(jié)合、與2分子葡萄糖結(jié)合和發(fā)生谷胱甘肽反應(yīng)反應(yīng)的產(chǎn)物；同時(shí)在膽汁中也發(fā)現(xiàn)了5種代謝產(chǎn)物，分別為去甲基化、雙氧化、三氧化、與1分子葡萄糖結(jié)合、葡萄糖苷酸化的產(chǎn)物。
　　 結(jié)論：HPLC-MS/MS法可以快速、簡捷、準(zhǔn)確地分析在芍藥苷和

10、芍藥內(nèi)酯苷大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。體內(nèi)和體外分析的結(jié)果表明二者存在一定的聯(lián)系。在體外微生物和腸內(nèi)菌的代謝模型中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化，說明所選的藥用真菌和腸內(nèi)菌中含有相同的酶系；而在體內(nèi)尿液和膽汁中未見這種轉(zhuǎn)化，可能是含有的酶不同，也可能是其他原因，有待進(jìn)一步研究。
　　 第五部分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷體外大鼠和人血漿蛋白結(jié)合率的測定
　　 目的：建立芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠血漿和人血漿中蛋白結(jié)合率的測定方法。

11、　　 方法：采用平衡透析法測定血漿蛋白結(jié)合率，將透析液置冰箱內(nèi)（溫度約4℃）平衡透析，確定48 h即可透析至平衡。采用高效液相色譜法測定血漿中藥物總濃度和游離藥物濃度，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。
　　 結(jié)果：1、5、10、15、20、30μg/ml的芍藥苷與大鼠血漿蛋白結(jié)合率分別為60.45％、67.60％、78.66％、74.07％、76.29％、74.27％；1、5、10、15、20、30μg/ml的芍藥內(nèi)酯苷與大鼠血漿蛋白結(jié)合