膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠及人滑膜細(xì)胞β-arrestins的表達(dá)及白芍總苷和芍藥苷的作用.pdf

1、目的:觀察膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜細(xì)胞β-arrestinl、β-arrestin2的表達(dá)以及白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)體內(nèi)給藥、芍藥苷(paeoniflorin，Pae)體外給藥后β-arrestinl、β-arrestin2表達(dá)的變化情況；人滑膜細(xì)胞經(jīng)IL-1β刺激后β-arrestin1、β-arrestin2的表達(dá)變化及Pa

2、e的作用；并進(jìn)一步探討β-arrestin2與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的關(guān)系，以深入探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的發(fā)病機(jī)理和TGP治療RA的藥理作用機(jī)制。 方法： 采用CCII足趾、尾根部和背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射并一周后加強(qiáng)免疫法誘導(dǎo)大鼠CIA模型，TGP(25、50、100mg·kg-1·d-1)、雷公藤多苷(

3、glucosides of tripterygiumwifordii，GTW)(40 mg·kg-1·d-1)灌胃給藥(intragastric injection administration，ig)(d14～d28)，檢測(cè)足爪腫脹度；血清CⅡ抗體濃度變化；MTT法檢測(cè)滑膜細(xì)胞的增殖；Western blot法檢測(cè)β-arrestins在疾病進(jìn)程中的表達(dá)變化和不同劑量TGP體內(nèi)給藥對(duì)β-arrestins表達(dá)的影響。 d28

4、CIA大鼠滑膜組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，取第3代滑膜細(xì)胞Pae(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)體外給藥，Western blot法檢測(cè)不同濃度Pae體外給藥對(duì)β-arrestins表達(dá)的影響。收集行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者滑膜組織，經(jīng)知情同意，采用組織塊培養(yǎng)法對(duì)人滑膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，取3代滑膜細(xì)胞，IL-1β刺激，觀測(cè)刺激后不同時(shí)間cAMP、PKA、β-arrestins的變化及Pae的作用；使用ERK抑制劑U0126觀

5、察對(duì)β-arrestin2表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.CIA大鼠滑膜組織中β-arrestin1和β-arrestin2的表達(dá)情況CIA大鼠致敏后，滑膜組織β-arrestin1表達(dá)水平變化無顯著性；而β-arrestin2表達(dá)水平于致敏后d14顯著升高，d28表達(dá)達(dá)到峰值，d35仍高于正常組水平，與炎癥的發(fā)展過程相一致，提示β-arrestin2在RA發(fā)病過程中起到了重要作用。 2.人滑膜細(xì)胞IL-1β刺激后不同

6、時(shí)間點(diǎn)cAMP、PKA、β-arrestin2的變化取3代滑膜細(xì)胞，于IL-1β刺激后2h、4h、8h、16h、24h，檢測(cè)cAMP水平、PKA活性，4h時(shí)cAMP顯著升高，8h后下降，24h時(shí)顯著降低；PKA活性于4h時(shí)顯著升高，隨后漸恢復(fù)至正常水平。 取3代滑膜細(xì)胞，于IL-1β刺激后0.3h、6h、12h、24h、48h檢測(cè)β-arrestin2的表達(dá)，于12h表達(dá)開始升高，24h達(dá)到峰值。 取3代滑膜細(xì)胞，加入U(xiǎn)

7、0126(25μM，50μM)或其溶媒培養(yǎng)2h后，加入IL-1β(終濃度10ng·ml-1)培養(yǎng)24小時(shí)，U0126(25μM，50μM)能明顯減少β-arrestin2的表達(dá)。 3.TGP對(duì)大鼠CIA的治療作用及TGP和Pae對(duì)β-arrestins表達(dá)的影響TGP(25、50、100mg·kg-1，ig，d14～d28)可明顯減輕CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評(píng)分。CIA大鼠血清CⅡ抗體水平顯著升高，TGP(25、50、100mg·

8、kg-1，ig，d14～d28)能明顯降低CⅡ抗體濃度。CIA大鼠關(guān)節(jié)病理可見明顯炎癥表現(xiàn)，TGP三個(gè)劑量組可不同程度的抑制關(guān)節(jié)炎癥。CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)(fibroblast-likesynoviocytes，F(xiàn)LS)增殖反應(yīng)增強(qiáng)，TGP(50、100mg·kg-1，ig，d14～d28)可抑制FLS增殖反應(yīng)。 取致敏d28 CIA組及TGP各用藥組大鼠滑膜組織，Western blot法檢測(cè)β-arrestinl和β-a

9、rrestin2表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TGP(50、100mg·kg-1，ig,d14~d28)能明顯減少致炎后β-arrestin2的表達(dá)，對(duì)β-arrestinl表達(dá)水平影響無顯著性。 d28 CIA大鼠處死后進(jìn)行滑膜細(xì)胞培養(yǎng)，取3代滑膜細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-arrestin2表達(dá)顯著升高，Pae(10-5、10-6、10-7 mol·L-1)體外給藥能明顯減少β-arrestin2的表達(dá)。7人滑膜細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后取3代滑膜細(xì)胞，加入Pa

10、e(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)作用后加入IL-1β刺激24h，與未用藥組相比，Pae(10-5、10-6、10-7 mol·L-1)能明顯減少β-arrestin2的表達(dá)。 結(jié)論： 1.CIA大鼠滑膜組織中β-arrestin2的表達(dá)水平隨著病程發(fā)展而升高，與炎癥的發(fā)展過程相一致。 2.人滑膜細(xì)胞經(jīng)IL-1β刺激后，β-arrestin2的表達(dá)上調(diào)，這可能是引起G蛋白偶聯(lián)受體

11、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過度脫敏，滑膜細(xì)胞增殖的機(jī)制之一;ERK抑制劑U0126(25μM，50μM)能減少IL-1β刺激后β-arrestin2的表達(dá)，這可能與ERK的活化能促進(jìn)β-arrestin2表達(dá)有關(guān)。 3.TGP能明顯降低CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)，降低CⅡ抗體濃度，抑制滑膜細(xì)胞的增殖反應(yīng)，可以下調(diào)滑膜組織中異常升高的β-arrestin2表達(dá)；芍藥苷體外用藥同樣能下調(diào)CIA大鼠及IL1β刺激后人滑膜細(xì)胞中β-arrestin2的表