卟啉光動力納米藥物制備及腫瘤抑制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　化療是惡性腫瘤治療的主要手段之一。但傳統(tǒng)化療藥物缺乏腫瘤選擇性，毒副作用大，并且長期用藥導致腫瘤多藥耐藥，是造成化療失敗的重要原因。目前，肝癌患者尚沒有化療方案顯示出生存獲益，因為肝癌患者普遍對化療具有耐藥性，對化療不敏感。
　　光動力療法是近年來一種新興的腫瘤治療方案。光敏藥物進入體內，富集于病灶后，在匹配吸收波長的激光作用下，能生成活性很強的單態(tài)氧，產生細胞毒性作用。但由于光敏劑水溶性較差，臨床上很

2、難直接注射;此外，光敏劑穩(wěn)定性較差，很難在腫瘤部位長久富集，因此光動力治療目前在臨床只是做為輔助治療方案。
　　雖然這些治療手段在目前的腫瘤治療上發(fā)揮了重要的作用，但仍存在自身的弊端和無法完全抑制腫瘤的缺點，因此發(fā)展兩種或多種腫瘤治療手段協同作用的聯合治療方法，成為腫瘤治療研究領域的熱點。多功能納米載體能夠實現多種功能如長循環(huán)、靶向以及不同作用機制治療方法的有效整合，滿足臨床對腫瘤聯合治療的需求。
　　目前，已有大量關于多功

3、能納米藥物對腫瘤聯合治療的報導，但由于其生物相容性及生物可降解性等方面的局限，極大的限制了在臨床上的應用。本文擬設計并構建以生物體自有分子——血卟啉為基礎的可直接用于臨床注射的腫瘤靶向納米藥物，聯合光動力學治療與化療，考察其逆轉耐藥乳腺癌細胞ADR/MCF-7化療耐藥的作用和相關分子機制，及在耐藥乳腺癌、肝癌裸鼠荷瘤模型中的腫瘤靶向和體內抑瘤效果。
　　研究方法:
　　1)運用聚乙二醇修飾血卟啉合成光動力納米材料HPP，負載

4、抗腫瘤藥物阿霉素制成光動力納米藥物HPPD。利用核磁共振分析納米微粒的結構，透射電子顯微鏡及動態(tài)光散射研究其形貌及粒徑。高效液相色譜分析檢測藥物的體外釋放行為。
　　2)運用MTT法檢測游離藥物組Dox，納米藥物組HPPD及聯合光動力療法處理組HPPD，ADR/MCF-7細胞中藥物半數抑制濃度和細胞增殖能力的變化。流式細胞術定量檢測不同處理組細胞對藥物的攝取。激光共聚焦觀察藥物在耐藥乳腺癌及親本細胞中的藥物分布和亞細胞定位。

5、>　　3)流式細胞術檢測細胞凋亡。激光共聚焦檢測細胞色素c的亞細胞定位，Western blot檢測線粒體凋亡通路關鍵成員的蛋白表達變化。
　　4)建立耐藥乳腺癌、肝癌裸鼠皮下模型及狨猴肝癌原位模型，Cy5.5熒光標記納米藥物HPPD，活體動物成像考察其腫瘤靶向性。
　　5)尾靜脈注射游離藥物Dox或納米藥物HPPD，繪制腫瘤生長曲線，考察體內抑瘤效果。HE染色檢測HPPD的生物安全性;HPLC檢測藥物在各組織臟器的分布;血

6、清生化檢測分析不同處理組阿霉素的心臟毒性。
　　結果:
　　1)核磁譜圖結合透射電子顯微鏡結果表明，聚乙二醇通過酰胺鍵與血卟啉偶聯形成具有核殼結構的光動力納米膠束HPP，外形為球形或接近球形，粒徑為24.38±1.02 nm。HPP能夠高效負載阿霉素，載藥納米微粒HPPD的粒徑為35.60±2.05 nm，體外釋放結果表明藥物具有顯著的pH敏感釋放特性，并且結合光照后，藥物在弱酸性環(huán)境中的釋放速率進一步加快。
　　2)

7、和游離阿霉素相比，HPPD結合光照治療組對阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞（ADR/MCF-7）生長的抑制作用顯著增加，有效逆轉了細胞的耐藥性，逆轉指數高達12。
　　3)激光共聚焦觀察表明，游離阿霉素主要分布于ADR/MCF-7細胞的細胞漿;HPPD可實現阿霉素由胞漿到胞核的轉位，結合光照治療后，藥物在胞核中的分布進一步增加。流式細胞術結果進一步證明，聯合治療法有效增加了耐藥細胞對阿霉素的攝取。
　　4)流式細胞術分析表明HPPD

8、結合光照治療顯著誘導了耐藥細胞的凋亡。激光共聚焦觀察發(fā)現細胞色素c從線粒體釋放到胞質中，Western blot結果表明細胞漿中細胞色素c和凋亡誘導因子表達明顯升高。
　　5)皮下接種ADR/MCF-7細胞，構建異位移植瘤裸鼠模型，尾靜脈給藥，結果顯示游離的阿霉素或HPP結合光照后不能顯著抑制腫瘤的體內生長;而HPPD治療裸鼠三周后，實現了腫瘤的完全消除，結合光照后，兩周即可完全抑制腫瘤生長。此外，HPPD對于肝癌皮下模型也具有很

9、好的腫瘤抑制效果。
　　6) HPPD具有較好的體內腫瘤靶向性。ADR/MCF-7皮下成瘤裸鼠尾靜脈注射給藥后2h后，HPPD主要富集于腫瘤組織和腎臟;24h后，只在腫瘤部位觀測到較強的熒光信號，表明HPPD有很好的腫瘤滯留性。此外MHCC-97H肝癌皮下成瘤裸鼠以及DENA藥物誘導的肝癌原位模型狨猴體內也觀察到類似的實驗結果。
　　7)尾靜脈注射游離阿霉素和HPPD24 h后，用HPLC考察藥物在裸鼠體內分布。相對于游離藥

10、物組，HPPD在腫瘤內的藥物分布提高至2-3倍，心臟分布降低了約55％。
　　HPPD能顯著降低阿霉素的毒性。在耐藥乳腺癌和肝癌皮下荷瘤模型中，相對于游離藥物組，心肌磷酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)表達明顯降低;H&E結果表明，HPPD處理組對裸鼠的組織臟器沒有毒性;血清生化試驗表明，HPPD可有效減少阿霉素的心臟毒性。
　　結論:
　　本文設計并構建了一種結構簡單、生物安全的基于生物體自有材料——血卟啉的納米藥