血卟啉單甲醚光動(dòng)力學(xué)療法抑制增生性瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 增生性瘢痕(HS)是成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的纖維化疾病，是醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題。本文研究以血卟啉單甲醚(HMME)為光敏劑的光動(dòng)力學(xué)療法(PDT)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞(HSF)增殖與功能的影響并初步探討其作用機(jī)制，在動(dòng)物瘢痕模型上觀察HMME-PDT的生物學(xué)效應(yīng)，為臨床應(yīng)用HMME-PDT防治增生性瘢痕提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．HSF對(duì)HMME的吸收特性及HMME-PDT對(duì)其增殖效應(yīng)的研究：

2、取原代培養(yǎng)的第4～6代HSF，經(jīng)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)孵育濃度(0～40μg/ml)和孵育時(shí)間(0～120min)對(duì)HSF細(xì)胞吸收HMME的影響；MTT法檢測(cè)HMME-PDT對(duì)HSF細(xì)胞存活率的影響；銀染法檢測(cè)HSF中核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白(AgNORs)的表達(dá)情況；FCM分析細(xì)胞周期的變化。 2．HMME-PDT對(duì)HSF中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響：用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)HMME-PDT后HSF分泌至上

3、清液的TGF-β1蛋白表達(dá)量；用Smad3-FITC標(biāo)記后在熒光顯微鏡上觀察細(xì)胞內(nèi)Smad3的熒光強(qiáng)度；將細(xì)胞分為對(duì)照組、光敏劑組、照光組和HMME-PDT組，經(jīng)Western-blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞漿內(nèi)TGF-β1、磷酸化和非磷酸化Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)量。 3．HMME-PDT誘導(dǎo)HSF凋亡效應(yīng)的研究：Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡上觀察HMME-PDT后HSF細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；Annexin V-FI

4、TC-PI雙染后經(jīng)FCM檢測(cè)HMME-PDT后HSF細(xì)胞凋亡率和壞死率；將HSF爬片后分為對(duì)照組、HMME-PDT組和Z-DEVD-FMK抑制劑組，Caspase3-FITC-PI染色后在熒光顯微鏡上觀察各組細(xì)胞內(nèi)Caspase3的熒光強(qiáng)度；收集各組細(xì)胞在active-Caspase3-FITC單染后經(jīng)FCM檢測(cè)active-Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞百分率；收集各組細(xì)胞在PI單染后經(jīng)FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 4．HMME-PDT對(duì)

5、兔耳瘢痕的效應(yīng)研究：建立兔耳瘢痕模型后，將瘢痕塊分為不同組別，照光功率密度為20mW/cm2，光敏劑劑量為10mg/kg，分別在給藥后即刻、0.5、1、3h給予2.5、5、10、20J/cm2的能量密度照光，治療后第10天用游標(biāo)卡尺測(cè)量并計(jì)算瘢痕增生指數(shù)(HI)；HE染色后觀察瘢痕厚度、細(xì)胞及膠原分布等形態(tài)學(xué)變化；觀察HMME-PDT后瘢痕中微血管數(shù)量、形態(tài)變化，采用Weidner計(jì)數(shù)方法，計(jì)算平均微血管密度(MVD)；運(yùn)用透射電鏡觀察

6、兔耳瘢痕增生塊中成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果： 1．在一定孵育濃度范圍內(nèi)(0～40μg/ml)，HSF細(xì)胞對(duì)HMME的吸收量隨孵育濃度的增高和孵育時(shí)間的增加而增大。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的HMME-PDT對(duì)HSF細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與孵育濃度和激光能量密度正相關(guān)；HMME-PDT能夠減少HSF細(xì)胞中AgNORs的含量，使I．S％值降低；HMME-PDT降低HSF增殖指數(shù)，改變各期細(xì)胞的分布比例，抑制S期DNA合成，使細(xì)胞滯留在G0/G

7、1期。 2．HSF分泌至細(xì)胞上清液的TGF-β1蛋白含量較高，而HMME-PDT后降低；HSF合成的TGF-β1蛋白水平高，HMME-PDT后HSF中的TGF-β1和磷酸化Smad3蛋白含量減少，Smad7蛋白含量增加，光敏劑組和照光組中上述蛋白的表達(dá)無(wú)顯著改變；PDT不能改變HSF內(nèi)Smad3蛋白表達(dá)量，但其在細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生變化，進(jìn)入細(xì)胞核的Smad3蛋白減少。 3．HMME-PDT治療后細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚，呈團(tuán)塊

8、顆粒狀，或呈波紋狀、折縫樣改變；Annexin V-FITC-PI雙染結(jié)果表明PDT后凋亡率顯著升高，并伴有細(xì)胞壞死的發(fā)生，但組內(nèi)壞死率低于凋亡率；對(duì)照組和Z-DEVD-FMK抑制劑組HSF的細(xì)胞漿中Caspase3-FITC熒光微弱，PDT組熒光顯著增強(qiáng)；對(duì)照組active-Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞百分率低，HMME-PDT組上升，Z-DEVD-FMK組降低；PI染色分析表明對(duì)照組凋亡率低，PDT組的凋亡率顯著升高，Z-DEVD-F

9、MK組的凋亡率低于PDT組，但仍然顯著高于對(duì)照組。 4．在本研究的兔耳增生性瘢痕塊中，靜脈注射HMME10mg/kg后30min，給予功率密度為20mW/cm2，能量密度為5J/cm2的630nm紅光照射能對(duì)瘢痕塊產(chǎn)生較理想的抑制效應(yīng)；對(duì)照組兔耳瘢痕塊真皮層顯著增厚，血管分布豐富，HMME-PDT組瘢痕塊厚度下降，MVD顯著減少；在透射電鏡下觀察到對(duì)照組中有大量HSF，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，高爾基體發(fā)達(dá)，線粒體增加，PDT組胞漿

10、內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)萎縮且數(shù)量減少，核蛋白體有不同程度的脫顆粒和解聚，胞質(zhì)中見(jiàn)較多游離核糖體，線粒體腫脹，嵴溶解。 結(jié)論： 1．HSF對(duì)HMME的吸收隨孵育濃度和孵育時(shí)間的增加而增加，HMME-PDT處理HSF時(shí)，光敏劑孵育濃度和激光能量密度是影響細(xì)胞存活率的重要因素，PDT改變各期細(xì)胞的分布比例，抑制細(xì)胞增殖。 2．HMME-PDT能夠阻止TGF-β1的信號(hào)經(jīng)由Smad蛋白傳向細(xì)胞核，改變TGF-β1、磷酸化Smad3

11、和Smad7在HSF細(xì)胞水平的表達(dá)，使細(xì)胞增殖及膠原合成有關(guān)的靶基因得不到激活，從而抑制HSF增殖和膠原合成。 3．HMME-PDT誘導(dǎo)HSF發(fā)生的凋亡效應(yīng)與Caspase-3的激活密切相關(guān)，但該凋亡效應(yīng)并不依賴于Caspase-3，可能與AIF等因子的釋放或其它信號(hào)途徑的激活有關(guān)。 4．HMME-PDT對(duì)兔耳增生性瘢痕的生物學(xué)效應(yīng)是一個(gè)光動(dòng)力綜合作用的結(jié)果，與光敏劑的劑量和激光照光時(shí)間、給藥后至照光的時(shí)間間隔及能量密度