角質(zhì)細胞生長因子在膿毒癥大鼠腎臟中的動態(tài)變化及意義.pdf

1、目的： 膿毒癥(sepsis)是指機體被血液或組織中的各種致病微生物或其毒素侵襲所致的一種全身性炎癥反應，可導致器官損傷甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)。腎臟是膿毒癥早期最易受損的器官之一。對膿毒癥急性腎損傷的早期干預，是膿毒癥治療中不容忽視的問題。角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factors，KGFs)屬于成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)，是一類

2、能與肝素結(jié)合的重要的多肽生長因子，目前有兩個成員，即KGF-1(也叫FGF-7)和KGF-2(也叫FGF-10)，由間充質(zhì)細胞產(chǎn)生，以自分泌或旁分泌的方式特異性刺激上皮細胞的增殖，與器官發(fā)育和自穩(wěn)有關(guān)。對各種類型的上皮細胞來說，KGF是一種有效而特殊的分裂素，能夠保護細胞免受各種損傷，對受損上皮組織的修復具有重要作用。目前KGFs在口腔、喉粘膜、中耳膽脂瘤以及急性肺損傷、腸輻射損傷、腫瘤等中的表達及意義已有相關(guān)報道。而關(guān)于KGFs在膿毒

3、癥受損腎臟中的表達及修復方面的報道較少。本實驗通過建立膿毒癥大鼠模型，研究KGFs在膿毒癥受損腎臟中的動態(tài)變化及意義，探討膿毒癥病理過程中腎臟損傷修復的部分機制。 方法： 一、動物模型及分組 本實驗是在中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院實驗動物中心完成。6周齡WISTER健康雄性大鼠80只，體重160～210克，以隨機排列表法隨機分為：膿毒癥組(A組)40只、假手術(shù)組(B組)40只。用CLP法制備膿毒癥大鼠模型。A、B兩組均設(shè)

4、3h、6h、12h、24h和36h五個亞組，每亞組8只，分別在各時間點留取標本。 二、標本采集及處理 腹主動脈抽血2ml，1.5ml離心3000轉(zhuǎn)/分15分鐘，取血清待測血肌酐、尿素氮，0.5ml待測白細胞。取大鼠左腎切開置于10％福爾馬林中固定，石蠟包埋，HE染色法光鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)改變。取大鼠右腎，剝離表面脂肪后包入無菌錫紙中置液氮罐內(nèi)，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，待做免疫組化和實時熒光定量PCR。 三、實驗方法

5、 采用生化自動分析儀檢測血肌酐、尿素氮；免疫組化SABC染色法檢測腎臟組織中KGF-1、KGF-2蛋白表達；實時熒光定量PCR法檢測腎臟組織中KGF-1mRNA及KGF-2mRNA的相對表達量。 四、統(tǒng)計學分析 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析和t檢驗、pearson相關(guān)分析，以α=0.05(雙側(cè))為檢驗水準，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：

6、 一、肉眼觀各組腎臟的改變 A組腎臟表面色澤暗紅，術(shù)后24h可見包膜下點狀、片狀出血，觸之較硬，彈性差；B組腎臟表面有輕度充血、水腫，彈性較好。 二、光鏡下HE染色各組腎臟的改變 A組腎臟24h可見腎小管空泡變性，大量中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞浸潤，局部有點狀出血、壞死，依據(jù)文獻中張氏腎損害分級標準，符合Ⅲ級腎損害。B組較正常無明顯改變。 三、血生化指標的改變 A組血肌酐、尿素氮均術(shù)

7、后24h達峰值，除3h與B組無顯著差別外，6h、12h、24h、36h均高于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 四、免疫組化染色及圖象分析 KGFs在A、B兩組腎臟中均有表達，主要集中在髓質(zhì)腎小管，皮質(zhì)腎小管也有分布。光鏡下腎小管上皮細胞胞漿染色，可見棕黃色、深褐色顆粒。 KGF-1動態(tài)變化：與B組相比，A組術(shù)后3h無顯著增高(P>0.05)，術(shù)后6h表達最強，12h有所回落，24h出現(xiàn)第二次峰，36h

8、又有所下降，但均明顯高于B組(P<0.01)。而B組各時點無顯著波動。 KGF-2動態(tài)變化：與B組相比，A組術(shù)后3h、6h均無顯著差異(P>0.05)。術(shù)后12h表達最強，較B組顯著增高(P<0.01)，之后逐漸下降，但24h(P<0.05)、36h(P<0.01)仍強于B組對應時點。 五、實時熒光定量PCR KGF-1動態(tài)變化：術(shù)后3h，A組與B組KGFmRNA相對拷貝數(shù)無顯著差異(P>0.05)。此后A組

9、KGF表達量迅速上升，術(shù)后6h達峰值，12h有所下降，24h再次上升，36h又有回落，較B組均有顯著差異(P<0.01)。而B組僅6h略有上升，其余各時點無明顯波動。 KGF-2動態(tài)變化：術(shù)后3h、6h，A組與B組KGFmRNA相對拷貝數(shù)無顯著差異(P>0.05)。A組術(shù)后12h表達量達峰值，此后逐漸下降，12h、24h、36h均較B組有顯著差異(P<0.01)。 六、KGFs與BUN、Cr的相關(guān)性分析 KG

10、F-1mRNA:與BUN成正相關(guān)，r=0.504，P=0.001<0.01；與Cr成正相關(guān)，r=0.3829 P=0.015<0.05。 KGF-2mRNA:與BUN成正相關(guān)，r=0.426，P=0.006<0.01；與Cr成正相關(guān)，r=0.555，P=0.000<0.01。 結(jié)論： 1、KGFs在正常大鼠腎臟中即有表達，主要集中在髓質(zhì)腎小管上皮細胞，皮質(zhì)腎小管也有分布。KGF-2的表達量較少，KGF-1表達量