下調ubc9對人肝星狀細胞增殖的影響及其機制研究.pdf

1、背景:
　　肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對不同病因所致的慢性肝臟疾病的病理學綜合征,是各種慢性肝病發(fā)展的必經階段。在整個肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)的激活是一個關鍵環(huán)節(jié)。活化的HSCs能過量表達α-平滑肌肌動蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)并合成異常增多的細胞外基質(Extracellular C

2、ell Matrix,ECM)超過肝臟的代謝能力從而導致其在肝內大量聚集。HSCs活化的初始階段主要是由鄰近細胞(如肝細胞、Kupffer細胞等)通過旁分泌作用啟動的。此外,HSCs還可分泌一些細胞因子促進Kupffer細胞激活以及通過自分泌或者旁分泌促進自身進一步激活。
　　小泛素樣分子相關修飾物(small ubiquitin-like modifier, SUMO)是一種類泛素樣蛋白,與泛素(ubiquitin)泛素介導的蛋

3、白降解途徑不同,SUMO化的結果并不是將靶蛋白降解,而是通過修飾來增強它們的穩(wěn)定性或者調節(jié)其亞細胞定位及影響其轉錄活性,從而發(fā)揮更加廣泛的作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進展,SUMO-1的表達量逐漸增加。SUMO-1可能通過增強TGF-β1及PDGF的表達,進而促進HSC的增殖和活化,促進其分泌膠原,表現(xiàn)出促肝纖維化作用。SUMO化修飾過程需要多種酶參與,但只有唯一的接合酶-ubc9。因此,我們推斷ubc9可能通過調節(jié)SUMO化

4、參與肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生發(fā)展。為進一步研究ubc9在肝纖維化過程中的作用及其機制,本實驗首先利用RT-PCR和Western blot檢測正常肝細胞株L02、人源性肝星狀細胞株LX-2和肝癌細胞HepG2、SMMC-7721內ubc9的表達量。再將pcDNA6.2-mir ubc9瞬時轉染LX-2,以Western blot方法檢測轉染前后LX-2細胞內ubc9、α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2等基因的表達情況,以ELISA分

5、析轉染前后LX-2細胞分泌TNF-α與IL-6的變化,以流式細胞術分析轉染前后LX-2細胞凋亡與周期的變化情況。以期闡明ubc9在肝纖維化中的作用機制。
　　目的:
　　探討ubc9在LX-2細胞活化與增殖過程中的作用及其機制
　　方法:
　　分別在體外培養(yǎng)正常肝細胞株L02、肝星狀細胞株LX-2和肝癌細胞HepG2、SMMC-7721后提取RNA及蛋白質,再利用RT-PCR及western blot檢測ubc9

6、的表達水平;將人工合成的針對ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9質粒轉染LX-2,采用RT-PCR及western blot方法檢測轉染后LX-2中ubc9的表達變化,以western blot方法檢測轉染后LX-2中α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2的表達變化,以ELISA分析轉染前后LX-2細胞分泌TNF-α與IL-6的變化,以流式方法檢測各實驗組LX-2細胞的周期及凋亡。
　　結果:
　　RT-PCR

7、與Western blot檢測發(fā)現(xiàn)正常肝細胞、肝星狀細胞和肝癌細胞內均會表達ubc9基因;人工合成的針對ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9質粒能抑制LX-2細胞中ubc9、α-SMA、p65及Bcl-2基因的表達,同時能增加IKBα的表達,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉染后LX-2的周期被阻滯在G2/M期,并且能夠促進LX-2的凋亡,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結果說明,下調ub