肌肉注射sRAGE基因?qū)TZ誘導(dǎo)的高脂餐大鼠2型糖尿病發(fā)病的影響.pdf

1、背景高脂肪飲食已經(jīng)成為當(dāng)前主要的飲食結(jié)構(gòu)，與已成流行趨勢的2型糖尿病發(fā)病相伴隨。高溫烹制的高脂肪餐富含晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs，又稱糖毒素，glucotoxing)。AGEs與其受體(RAGE)結(jié)合后可誘導(dǎo)發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。IR是2型糖尿病主要發(fā)病機(jī)制之一。因此推測：長期進(jìn)食富含AGEs的食物，使循環(huán)中AGEs超

2、過了機(jī)體的清除能力；AGEs可以通過與其受體RAGE結(jié)合，使體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致胰島素抵抗，從而引起糖尿病發(fā)病。抑制AGEs形成、促進(jìn)AGEs降解、阻斷AGEs與RAGE的結(jié)合可減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激。因此，干預(yù)AGEs-RAGE系統(tǒng)可能有助于阻斷糖尿病的發(fā)病過程。 目的：構(gòu)建大鼠可溶性RAGE(soluble RAGE，sRAGE)基因表達(dá)載體，觀察sRAGE表達(dá)對高脂餐誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)氧化水平以及對大鼠糖尿病發(fā)病率的影響。

3、 方法 1.sRAGE基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建從大鼠肺組織中提取總RNA，根據(jù)其編碼區(qū)基因設(shè)計(jì)引物，并在引物中加入SalI和ClaI酶切位點(diǎn)；行RT-PCR，將RT-PCR產(chǎn)物克隆到pMDl8-T simple Vector中篩選陽性克隆并對插入片段(sRAGE)測序。用SalI和ClaI酶切pMD 18-sRAGE，得到插入片段sRAGE，將該片段定向克隆至pLNCX<,2>質(zhì)粒的CMV啟動子的下游(命名為pLNCX<

4、,2>-sRAGE)，篩選陽性克隆并對插入片段(sRAGE)測序。 2.質(zhì)粒擴(kuò)增與純化應(yīng)用大腸桿菌擴(kuò)增pLNCX<,2>-sRAGE以及pLNCX<,2>，堿裂解法提取質(zhì)粒。 3．大鼠骨骼肌注射pLNCX<,2>-sRAGE后sRAGE表達(dá)的檢測取雄性SD大鼠6只(體重300g±10g，12周齡)，隨機(jī)分為2組。一組單側(cè)骨骼肌轉(zhuǎn)染pLNCX<,2>-sRAGE質(zhì)粒300gg，一組單側(cè)骨骼肌轉(zhuǎn)染pLNCX<,2>質(zhì)粒30

5、0μg，各組大鼠轉(zhuǎn)染后均使用轉(zhuǎn)基因儀給予方波電脈沖刺激增強(qiáng)其轉(zhuǎn)染效率；一周后處死動物，取注射部位肌肉提取總RNA，并使用RT-PCR的方法檢測sRAGE基因在大鼠肌肉組織mRNA水平的表達(dá)。 4．大鼠骨骼肌注射pLNCX<,2>-sRAGE對大鼠體內(nèi)氧化水平的影響4．1 預(yù)實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠12只(體重150～160g，6周齡)，隨機(jī)分為3組，每組4只： (1)高脂餐喂養(yǎng)+pLNCX<,2>-sRAGE組：高脂飼料喂養(yǎng)8周后雙側(cè)股

6、四頭肌轉(zhuǎn)染pLNCX<,2>-sRAGE質(zhì)粒，每側(cè)300gg。 (2)高脂餐喂養(yǎng)+pLNCX<,2>組：高脂飼料喂養(yǎng)8周后雙側(cè)股四頭肌轉(zhuǎn)染pLNCX<,2>質(zhì)粒300μg。 (3)普通飼料對照組：喂養(yǎng)普通飼料，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。各組大鼠于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒前以及轉(zhuǎn)染后每一周取血，檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。 4．2正式實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠20只(體重150～160g，6周齡)，隨機(jī)分為2組(每組10只)： (1)高脂餐喂養(yǎng)

7、+pLNCX<,2>-sRAGE組，(2)高脂餐喂養(yǎng)+pLNCX<,2>組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法、劑量與預(yù)實(shí)驗(yàn)同。各組大鼠在轉(zhuǎn)染第一次質(zhì)粒3周時(shí)重復(fù)注射質(zhì)粒一次，劑量同上；分別于2次轉(zhuǎn)染前以及轉(zhuǎn)染后7天、14天、21天、斷尾取血測定SOD、MDA，評價(jià)其體內(nèi)的氧化水平。 5．肌肉注射pLNCX<,2>-sRAGE轉(zhuǎn)染對大鼠糖尿病發(fā)病率的影響方法4.2中高脂喂養(yǎng)的2組大鼠(每組n=10)在第二次轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的第三周后腹腔注射鏈脲佐菌素(S

8、TZ)30mg/kg：另取普通飼料喂養(yǎng)的20周齡雄性SD大鼠10只(350-380g)，隨機(jī)分為2組：一組(n=5)注射同等劑量STZ(3 0mg/kg)；另一組(n=5)注射生理鹽水。一周后測空腹血糖，以空腹血糖≥7.0mmol/L為達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。 6．高脂喂養(yǎng)的大鼠不同處理組血胰島素水平及胰島胰島素含量情況高脂喂養(yǎng)的大鼠注射STZ前采血，ELISA法測定血清胰島素水平以及血糖水平。注射STZ一周后處死大鼠，取胰腺固定

9、，石蠟切片，行胰島素免疫組化染色，觀察胰島細(xì)胞胰島素分泌情況。 結(jié)果 1．酶切和測序證實(shí)構(gòu)建的sRAGE基因表達(dá)載體序列正確。 2．肌肉注射pLNCX<,2>-sRAGE后，注射部位肌肉mRNA用RT-PCR可以檢測到sRAGE的mRNA表達(dá)。 3.高脂飲食+pLNCX<,2>-sRAGE組與高脂喂養(yǎng)+pLNCX<,2>組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(382g vs 380g，t=0.120，p=0.906)。

10、 4.轉(zhuǎn)染pLNCX<,2>-sRAGE后大鼠體內(nèi)MDA水平開始下降，其作用可持續(xù)3周，第2周起的水平與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.36 vs 6.79，t=-7.458，p=0.000)；SOD水平逐漸上升，第3周開始與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(152 vs 140，t=2.801，p=0.025)。重復(fù)注射后，MDA水平仍然可以下降，趨勢同前；SOD水平則繼續(xù)升高，但在第二次轉(zhuǎn)染后2周后達(dá)到一定水平后則不再升高。 5.肌

11、肉注射pLNCX<,2>-sRAGE組大鼠注射小劑量STZ后10只中僅有2只大鼠空腹血糖>7.0mmol/L，對照組10中則有8只空腹血糖>7.0mmol/L。普通飼料喂養(yǎng)的2組大鼠無糖尿病發(fā)生。三組空腹血糖均值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 6.高脂喂養(yǎng)并肌肉注射pLNCX<,2>-sRAGE、注射pLNCX<,2>及普通飼料喂養(yǎng)的大鼠在注射STZ前血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為4.81±0.472mmol/L、4.92±0.45mmol/L和4.

12、96mmol/L±0.435mmol/L)； pLNCX<,2>-sRAGE組大鼠的血清胰島素水平明顯低于PLNCX<,2>組大鼠，但高于普通飲食的同齡大鼠。 7．大鼠胰島免疫組化染色顯示高脂喂養(yǎng)的2組大鼠胰島分泌胰島素含量均低于普通飲食組大鼠。與pLNCX<,2>組大鼠比較pLNCX<,2>-sRAGE組大鼠胰島結(jié)構(gòu)更加完整，胰島素含量更接近普通飲食大鼠。 結(jié)論 1.成功地構(gòu)建了大鼠sRAGE基因表達(dá)載體pL