沙冬青抗寒基因的克隆、功能分析與遺傳轉(zhuǎn)化研究

1、沙冬青抗寒基因的克隆、功能分析與遺傳轉(zhuǎn)化研究沙冬青抗寒基因的克隆、功能分析與遺傳轉(zhuǎn)化研究（作者：劉美芹，導(dǎo)師：尹偉倫教授）（作者：劉美芹，導(dǎo)師：尹偉倫教授）摘要摘要低溫是影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子，揭示植物的抗寒機(jī)理，培育抗寒新品種具有重要的理論和實(shí)際意義。至今人們對(duì)植物低溫抗性獲得機(jī)制的了解仍很有限，尤其是對(duì)寒溫帶木本植物獲得順利越冬抗寒力的過程了解更少，而寒溫帶木本植物對(duì)維持北方寒冷地區(qū)的生態(tài)平衡起重要作用。本文針對(duì)生態(tài)建設(shè)

2、中缺乏抗寒植物的生產(chǎn)急需問題，對(duì)我國(guó)北方內(nèi)蒙古荒漠地區(qū)特有的常綠闊葉灌木沙冬青的抗寒性分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，期望為抗寒良種選育及生物工程定向育種提供理論和技術(shù)支持。沙冬青是亞洲中部的一種強(qiáng)抗逆植物，生長(zhǎng)在荒漠地帶，是國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物，對(duì)維持當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡起著重要的作用。沙冬青具有耐熱、旱、鹽堿等多種抗性，尤其能忍受冬季30℃的低溫，是理想的研究植物抗寒性的材料。目前對(duì)沙冬青抗逆性的研究多限于細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的觀察，雖然分離到幾種熱穩(wěn)定的抗凍蛋

3、白但還沒有從次生代謝物產(chǎn)物及抗逆基因方面進(jìn)行研究的報(bào)道。據(jù)此，本文探討了多酚與沙冬青抗寒性的關(guān)系；首次用自行優(yōu)化的固相扣除雜交方法，從低溫馴化的沙冬青幼苗中克隆到多個(gè)低溫誘導(dǎo)基因并進(jìn)行了功能分析與GenBank注冊(cè)；將克隆到的其中一個(gè)基因AmCIP，通過煙草異位表達(dá)分析、亞細(xì)胞定位分析和原核表達(dá)分析等方法進(jìn)行了功能鑒定和三倍體毛白楊的應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究。主要研究結(jié)果如下：針對(duì)沙冬青次生代謝產(chǎn)物含量很高的特點(diǎn)，就多酚類物質(zhì)的含量與抗寒性的提高之

4、間的關(guān)系進(jìn)行了研究。將沙冬青幼苗在2℃6℃條件下馴化14天后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗寒力明顯提高。電鏡細(xì)胞化學(xué)定位方法觀察到經(jīng)低溫馴化的幼苗子葉細(xì)胞中，多酚類物質(zhì)在液泡、液泡膜附近大量積累。定量分析發(fā)現(xiàn)，低溫馴化使沙冬青子葉內(nèi)的多酚含量提高。說明低溫馴化后，沙冬青中具有抗氧化劑活性的多酚的積累，可能對(duì)抗寒力的提高起重要作用。低溫抗性是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀。本文選用自行優(yōu)化的固相扣除雜交技術(shù)，以分離克隆多個(gè)沙冬青低溫抗性基因。該優(yōu)化方法操作簡(jiǎn)單，快

5、捷，集多種扣除雜交方法的優(yōu)點(diǎn)于一體，可以同時(shí)分離得到多個(gè)全長(zhǎng)基因?？鄢蟮玫降暮蜻x基因，經(jīng)兩輪雜交篩選后，得到11個(gè)差異顯著且有編碼區(qū)的克隆，分別在GenBank上進(jìn)行了注冊(cè)，序列號(hào)是AY590122，AY843521，AY846361，AY846362，AY846363，AY846364，AY843522，AY843523，AY843524AY843525，AY843526。這11個(gè)克隆中有三個(gè)是全長(zhǎng)cDNA，含有完整的開放閱讀框，其

6、中兩個(gè)編碼區(qū)完全一致，都編碼植物防御素；另一個(gè)編碼植物L(fēng)EA蛋白。其余的8個(gè)克隆中有兩個(gè)是編碼低分子量的低溫干旱誘導(dǎo)蛋白的基因，兩個(gè)是編碼光合系統(tǒng)元件蛋白的基因，一個(gè)H轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase的mRNA相似基因以及一個(gè)1433脫水素的特性，這進(jìn)一步證明了AmCIP是類脫水素蛋白。純化后的AmCIP還能提高低溫條件下細(xì)菌的存活率，說明該蛋白對(duì)細(xì)胞具有低溫保護(hù)功能。將構(gòu)建好的目的基因上游是rd29A誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化三倍體毛白楊。經(jīng)基因

7、組PCR鑒定，初步確定目的基因已整合進(jìn)再生毛白楊植株中。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有融合AmCIP::GFP的再生植株的葉片和根中均有綠色熒光出現(xiàn)，說明Prd29AAmCIP::GFP融合片斷已整合進(jìn)毛白楊的基因組中?？傊疚难芯揩@得了多個(gè)沙冬青低溫誘導(dǎo)基因，揭示了沙冬青低溫抗性的提高是一個(gè)復(fù)雜的分子生理過程，是多種代謝途徑多個(gè)基因協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。主效基因AmCIP轉(zhuǎn)化煙草異位表達(dá)表明AmCIP能提高植物對(duì)低溫、干旱及高鹽的抗性；亞細(xì)胞定位