胃癌患者貧血情況調(diào)查及缺氧與不良預(yù)后的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分胃癌術(shù)后輔助化療前貧血發(fā)生情況調(diào)查 目的:探討胃癌術(shù)后輔助化療前貧血發(fā)生的危險(xiǎn)因素，進(jìn)而了解胃癌術(shù)后輔助化療前貧血的臨床特點(diǎn)和發(fā)病規(guī)律，為胃癌術(shù)后輔助化療前貧血的防治提供臨床資料。 方法:回顧性分析2005年1月-2008年12月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院接受輔助化療胃癌患者臨床資料。收集并詳細(xì)記錄患者的一般情況及腫瘤疾病治療轉(zhuǎn)歸資料，統(tǒng)計(jì)輔助化療前貧血的發(fā)生率及貧血的發(fā)病程度，從單因素、多因素兩個(gè)層面針對(duì)年齡、性

2、別、病理分期、手術(shù)術(shù)式、病理組織類型、血清白蛋白水平等諸方面對(duì)貧血發(fā)生發(fā)展的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果:232例胃癌術(shù)后輔助化療前患者，貧血發(fā)生率53．4％。單因素分析：年齡不小于60歲者貧血構(gòu)成比顯著高于年齡小于60歲的患者。女性患者貧血構(gòu)成比顯著高于男性患者。Ⅲ、Ⅳ期患者的貧血構(gòu)成比明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者。全胃切除術(shù)患者的貧血構(gòu)成比顯著高于遠(yuǎn)端胃次全切除術(shù)和近端胃次全切除術(shù)患者。血清白蛋白水平低于35g/L的患者貧血發(fā)生率明顯

3、高于不低于35g/L的患者。Logistic多因素逐步回歸分析表明年齡（比數(shù)比（OR）26．422，95％可信區(qū)間（CI）5．716～122．129）、血清白蛋白（OR4．987，95％CI1．840～13．514）、病理分期（OR4．590，95％CI1．488～14．163）、手術(shù)方式（OR9．440，95％CI2．313～38．535）是胃癌術(shù)后輔助化療前患者合并貧血的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 結(jié)論:本研究提示胃癌輔助化療前貧血的發(fā)

4、生與年齡、血清白蛋白、手術(shù)方式、分期等因素有相關(guān)性。高齡、營(yíng)養(yǎng)不良、全胃切除、中晚期患者更易發(fā)生貧血。 第二部分人胃癌細(xì)胞株SGC7901體外乏氧環(huán)境HIF-1α、VEGF-A、VEGF-D基因表達(dá)變化 目的:觀察缺氧干預(yù)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901缺氧誘導(dǎo)因子-1a（HIF-1a）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A（VEGF-A）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D（VEGF-D）表達(dá)的影響。 方法:體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC7901（37

5、℃，5％CO2，21％O2，74％N）。將SGC7901細(xì)胞分成乏氧0、4、16、24小時(shí)四組。將人胃癌細(xì)胞SGC7901乏氧干預(yù)0小時(shí)、4小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)。以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)四組HIF-1α、VEGF-A、VEGF-DmRNA的表達(dá)情況：免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)四組HIF-1α、VEGF-A、VEGF-D蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:0小時(shí)、4小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)HIF-1α

6、mRNA表達(dá)分別0．46±0．03、0．36±0．02、0．61±0．05、0．82±0．07；與0小時(shí)相比，4小時(shí)組HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄處于下降水平，16小時(shí)組HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄上升，24小時(shí)組轉(zhuǎn)錄達(dá)到最高水平。0小時(shí)組、4小時(shí)組、16小時(shí)、24小時(shí)VEGF-AmRNA表達(dá)分別是0．27±0．03、0．39±0．02、0．47±0．03、0．68±0．05；VEGF-DmRNA表達(dá)量分別0．31±0．02、0．42±0．

7、04、0．54±0．04、0．72±0．06；VEGF-AmRNA和VEGF-DmRNA表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。 0小時(shí)、4小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)分別0．27±0．02、0．37±0．03、0．53±0．03、0．86±0．07；VEGF-A蛋白表達(dá)分別0．24±0．02、0．34±0．01、0．49±0．03、0．96±0．07；VEGF-D蛋白表達(dá)分別0．23±0．01、0．32±0．02、0．5

8、6±0．05、0．77±0．06；HIF-1α、VEGF-A、VEGF-D蛋白表達(dá)量隨乏氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。 結(jié)論:胃癌細(xì)胞株SGC7901缺氧環(huán)境中，HIF-1α、VEGF-A、VEGF-DmRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加。 第三部分苦參堿聯(lián)合CL體外干預(yù)人胃癌細(xì)胞SGC7901上清液培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304的增殖與凋亡 目的：研究苦參堿聯(lián)合中藥刺梨提取物CL體外對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901上清液培養(yǎng)的人臍

9、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304增殖及凋亡的影響，探討其機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304兩種細(xì)胞。收集人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)上清液，抽濾后用DMEM培養(yǎng)液配成含6．25％、12．5％、25％、50％4個(gè)濃度組，分別干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304，以四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)上清液對(duì)細(xì)胞增殖的刺激作用，選用最佳濃度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)液中加

10、入苦參堿干預(yù)ECV-304，分為15μg/mL、30μg/mE、60μg/mE、120μg/mL、240μg/mL五個(gè)濃度，分別作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，以MTT法測(cè)定苦參堿對(duì)ECV-304細(xì)胞增殖的抑制情況。培養(yǎng)液中加入CL干預(yù)ECV-304，分為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mE、80μg/mE、160μg/mE五個(gè)濃度，分別作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，以MTT法測(cè)定CL對(duì)ECV-304細(xì)胞增殖的抑制情況；

11、培養(yǎng)液中加入苦參堿聯(lián)合CL干預(yù)ECV-304，分為10μg/mL+15μg/mL、20μg/mL+30μg/mL、40μg/mL+60μg/mL、80μg/mL+120μg/mL、160μg/mL+240μg/mL五個(gè)濃度，作用48小時(shí)，以MTT法測(cè)定苦參堿聯(lián)合CL對(duì)ECV-304細(xì)胞增殖的抑制情況；根據(jù)中效原理法判斷聯(lián)合用藥的相互作用；以RT-PCR法檢測(cè)Ki-67、Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)情況；以Western blot法檢

12、測(cè)Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1． MTT法檢測(cè)顯示：（1）SGC-7901上清液（6．25％、12．5％、25％、50％）干預(yù)ECV-304細(xì)胞后，吸光度值均高于空白對(duì)照組；（2）苦參堿（15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL、240μg/mL）干預(yù)SGC-7901上清液培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，吸光度值均低于空白對(duì)照組，且呈劑量依賴性；

13、（3）CL（10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL）干預(yù)SGC-7901上清液培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，吸光度值均低于空白對(duì)照組，且呈劑量依賴性；（4）苦參堿聯(lián)合CL（10μg/mL+15μg/mE、20μg/mL+30μg/mL、40μg/mL+60μg/mE、80μg/mL+120μg/mE、160μg/mE+240μg/mE）干預(yù)SGC-7901上清液培養(yǎng)EC

14、V-304細(xì)胞，在48小時(shí)，吸光度值均低于空白對(duì)照組，且呈劑量依賴性：（5）IC50濃度（70μg/mL）的苦參堿、IC50CL（75μg/mL）和1/2IC50苦參堿（35μg/mE）+1/2IC50（37．5μg/mE）CL干預(yù)SGC-7901上清液培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞，在48小時(shí)，聯(lián)合用藥組的吸光度值低于單獨(dú)用藥組。 2．中效原理計(jì)算得出：fa=0．81時(shí)兩藥合用指數(shù)CI=1，為相加效應(yīng)，fa<0．81時(shí)，兩藥合用指數(shù)C

15、I<1，為協(xié)同效應(yīng)，fa>0．81時(shí)，CI>1為拮抗效應(yīng)。 3． RT-PCR檢測(cè)顯示：以苦參堿（70μg/mE）、CL（75μg/mL）和苦參堿（37．5μg/mL）聯(lián)合CL（37．5μg/mE）干預(yù)SGC-7901上清液培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞48小時(shí)，聯(lián)合組的Ki-67mRNA和Bcl-2mRNA表達(dá)量明顯低于單藥組，BaxmRNA表達(dá)量明顯高于單藥組。 4． Western Blot檢測(cè)顯示：以苦參堿（75μg/m

16、L）、CL（75μg/mL）和苦參堿（37．5μg/mL）聯(lián)合CL（37．5μg/mL）干預(yù)SGC-7901上清液培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞48小時(shí)，聯(lián)合組的Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯低于單藥組，Bax蛋白表達(dá)量明顯高于單藥組。 結(jié)論:SGC-7901上清液（6．25％、12．5％、25％、50％）干預(yù)ECV-304細(xì)胞后，均促進(jìn)了ECV-304細(xì)胞的增殖；低濃度苦參堿聯(lián)合CL應(yīng)用與兩藥高濃度單獨(dú)應(yīng)用相比，對(duì)人胃癌細(xì)胞