Fat4低表達(dá)通過誘導(dǎo)Yap核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良.pdf

1、胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率排名第三的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與信號(hào)通路的失調(diào)密切相關(guān)。Hippo-Yap信號(hào)通路與消化系統(tǒng)的器官發(fā)育、組織修復(fù)有關(guān)，而且對(duì)胃癌細(xì)胞的生存、轉(zhuǎn)移等具有抑制作用，其效應(yīng)元件Yap是治療胃癌的重要靶點(diǎn)。Fat4是Fat鈣黏蛋白家族成員，作為一種單跨膜蛋白受體，與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞分化、組織發(fā)育有關(guān)。Fat4可以作為Hippo-Yap通路的上游信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)，其低表達(dá)會(huì)造成哺乳動(dòng)物腎臟、神經(jīng)管以及內(nèi)耳等的發(fā)育缺陷

2、。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)at4還能夠作為腫瘤抑制因子抑制胃癌細(xì)胞的增殖與遷移，但是Fat4在許多腫瘤包括胃癌中都存在基因突變導(dǎo)致的蛋白缺失。因此Fat4的缺失有可能與胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力的改變以及胃癌患者預(yù)后有關(guān)，并且可能與其參與Hippo-Yap信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，但是其相關(guān)性及發(fā)生機(jī)制尚未闡明。
　　目的:
　　研究Fat4的低表達(dá)與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、耐藥性等生物學(xué)行為的相關(guān)性;探討Fat4的表達(dá)異常對(duì)胃癌細(xì)胞中Hipp

3、o-Yap信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制;明確Fat4的表達(dá)與胃癌組織的臨床病理學(xué)特征及患者預(yù)后之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.1)通過基因干擾技術(shù)(Fat4-shRNA)敲低Fat4在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，應(yīng)用Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fat4低表達(dá)對(duì)Yap、p-Yap、LATS、p-LATS、CyclinD1及c-Myc蛋白表達(dá)的影響;
　　2)采用MTT、平板克隆及裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fat4敲低對(duì)胃癌細(xì)胞增值能力

4、的影響;
　　3)通過流式細(xì)胞術(shù)分析Fat4敲低對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響;
　　4)采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察Fat4敲低對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。
　　2.1)通過Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fat4敲低的胃癌細(xì)胞(shFat4細(xì)胞)的胞漿蛋白與胞核蛋白中的Yap、p-Yap、β-catenin的蛋白表達(dá)水平，以及Yap敲低的胃癌細(xì)胞(shYap細(xì)胞)中胞漿p-Yap與β-catenin蛋白的表達(dá)水平;<

5、br>　　2)通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fat4敲低及Yap敲低的胃癌細(xì)胞中Fat4、Yap、β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平;
　　3)將Fat4全長(zhǎng)基因克隆至胃癌細(xì)胞使其過表達(dá)(Fat4細(xì)胞)，或克隆至Fat4細(xì)胞(shFat4+Fat4細(xì)胞)或shCtrl細(xì)胞(shCtrl+Fat4細(xì)胞)中，并通過Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fat4、p-Yap、Yap、CyclinD1及MMP-7的蛋白表達(dá);同時(shí)應(yīng)用流式

6、細(xì)胞術(shù)分析上述胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期;
　　4)通過MTT法檢測(cè)Fat4敲低的胃癌細(xì)胞在接受5-FU、順鉑、奧沙利鉑和紫杉醇處理后的存活率。
　　3.1)收集122例接受過胃癌D2根治術(shù)治療的患者的蠟塊組織及臨床病理資料;
　　2)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Fat4和Yap蛋白在122例胃癌組織及85例正常胃黏膜組織的表達(dá)情況;
　　3)通過Pearsonx2檢驗(yàn)探討Fat4表達(dá)量與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性;

7、　　4)采用Kaplan-Meier法及Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析研究Fat4的表達(dá)量與胃癌患者累積生存率的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.1) shFat4細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組胃癌細(xì)胞(shCtrl細(xì)胞)，其Fat4蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)p-Yap及p-LATS的蛋白表達(dá)也降低，但是Yap及LATS的蛋白表達(dá)沒有改變;
　　2) p-Yap與Yap蛋白水平的比值(p-Yap/Yap)和p-LATS與LATS蛋白水平的比

8、值(p-LATS/LATS)在shFat4胃癌細(xì)胞中顯著低于shCtrl細(xì)胞;
　　3) shFat4細(xì)胞的細(xì)胞相對(duì)于shCtrl細(xì)胞，其細(xì)胞活性升高(P＜0.05)，克隆形成數(shù)目增加(P＜0.05)，裸鼠皮下瘤的體積增大、生長(zhǎng)速度增快(P＜0.05);
　　4) shFat4細(xì)胞的細(xì)胞相對(duì)于shCtrl細(xì)胞，其在G1期的比例下降(50.69％ vs.30％，P＜0.05)，在G2/M期的比例升高(49.31％ vs.70％

9、，P＜0.05)，而且細(xì)胞周期蛋白CyclinD1及c-Myc的蛋白表達(dá)顯著增加;
　　5) Transwell小室中Fat4敲低的胃癌細(xì)胞吸光度值高于shCtrl細(xì)胞(1.57 vs.0.65， P＜0.05);Fat4敲低的胃癌細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組胃癌細(xì)胞，其遷移相關(guān)蛋白MMP-7、Cyr61增加而E-cadherin降低。
　　2.1) Fat4敲低的胃癌細(xì)胞相對(duì)于shCtrl細(xì)胞中，胞漿p-Yap蛋白水平降低，胞核Yap

10、蛋白水平升高，但是胞漿Yap蛋白水平不變;
　　2)相對(duì)于shCtrl細(xì)胞，shFat4細(xì)胞或shYap細(xì)胞的胞漿蛋白中的p-Yap表達(dá)水平降低但β-catenin表達(dá)水平升高;shFat4細(xì)胞或shYap細(xì)胞中的β-cateninmRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組沒有差異;
　　3) shFat4細(xì)胞相對(duì)于shCtrl細(xì)胞，其Fat4、p-Yap蛋白表達(dá)降低，CyclinD1及MMP-7蛋白表達(dá)升高，但是全長(zhǎng)Fat4過表達(dá)轉(zhuǎn)染使上

11、述蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn);shFat4細(xì)胞相對(duì)于shCtrl細(xì)胞，其S/G2/M期的胃癌細(xì)胞比例增加，但是可以被全長(zhǎng)Fat4過表達(dá)轉(zhuǎn)染所逆轉(zhuǎn)。
　　4)胃癌細(xì)胞接受5-FU、順鉑、奧沙利鉑和紫杉醇處理后，shFat4細(xì)胞的細(xì)胞生存率高于shCtrl細(xì)胞。
　　3.1)胃癌組織中Fat4蛋白的陰性染色顯著高于鄰近非胃癌組織(69％ vs.33％，P＜0.05);Fat4在胃癌組織的陽(yáng)性表達(dá)與胞核Yap的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(x2=24.

12、0484, P=0.0000);
　　2)Fat4的陰性染色與胃癌的淋巴管侵犯(P=0.0011)、腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.00166)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0007)呈正相關(guān);
　　3) Fat4的陰性染色與胃癌患者的累積生存率呈負(fù)相關(guān)(P=0.004)。
　　結(jié)論:
　　1.Fat4蛋白低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞內(nèi)p-Yap蛋白減少，并使胃癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程加快，以及遷移能力增強(qiáng);
　　2.Fat4蛋白